Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Белковых взаимодействий в основе функции клетки. Калориметрические и спектроскопические методы широко используются для их характеристики. Здесь мы опишем флуоресцентной анизотропии в качестве инструмента для изучения взаимодействия между белком мутировал в синдром Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации типа 1 GTPase (EFL1).

Общая цель этого эксперимента — оценить и количественно оценить взаимодействие между двумя белками, представляющими интерес, с помощью флуоресцентной анизотропии. Эти меры могут помочь ответить на ключевые вопросы. Область биохимии белка и биофизики белка, например, белка, взаимодействие которого важно для функционирования клетки.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем получить количественную и качественную информацию о белок-белковом взаимодействии. Чтобы приготовить очищенный белок SBDS-FlAsH, сначала приготовьте один литр жидкой среды LB с добавлением 100 мкг на миллилитр ампициллина. И в нем культура трансформировала бактерии при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет 0,5 до 0,7.

Индуцируйте экспрессию белка SBDS-FlAsH путем добавления 0,5 миллимолярного IPTG в культуру и продолжайте инкубацию еще в течение пяти часов. Затем соберите бактериальную суспензию центрифугированием при 3800 умноженных на G в течение десяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте клетки в 35 миллилитрах лизисного масла SBDS с добавлением одного миллимолярного PMSF. Лизируйте с помощью ультразвука в течение четырех минут, используя циклы по десять секунд включения и 30 секунд выключения при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте образец при 9 000 умноженных на G в течение 50 минут при четырех градусах Цельсия.

Оставьте надосадочную жидкость и выбросьте поддон для удаления клеточного мусора. После уравновешивания колонки сродства никеля с тремя объемами буфера для лизиса SBDS введите весь осветленный надосадочный продукт в колонку. Удалите несвязанный белок, промыв тремя колонками буфера для лизиса SBDS.

После промывки колонки элюируйте связанный белок тремя объемами буфера для элюирования SBDS. Для дальнейшей очистки белка уравновесьте колонку сульфопропилкатионита тремя объемами колонок буфера с низким содержанием солей S-колонки. Разведите белок в шесть раз с 50 миллимолярным фосфатным буфером PH 6,5 и введите его в колонку.

Промойте несвязанный материал тремя объемами колонного буфера с низким содержанием соли S. Затем элюируйте белок за один этап, добавив в колонку 50 миллимолярных фосфатных буферов PH 6,5, один моляр хлорида натрия. Разбавьте элюат в три раза 50 миллимолярным фосфатным буфером PH 6,5.

Затем сконцентрируйте белок с помощью устройств ультрафильтрации путем центрифугирования при 3800 G в течение пятнадцати минут. Качество белков, используемых в этом типе экспериментов, очень сильное. Интерпретация данных усложняется, если используемые образцы белка не отличаются высокой чистотой.

Проверьте чистоту белка SBDS-FlAsH с помощью анализа SDS-PAGE и окрашивания по Кумасси. Мгновенно заморозьте белок в жидком азоте и храните его при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Чтобы получить очищенный белок EFL1, сначала культивировали трансформированные дрожжи при 30 градусах Цельсия в одном литре синтетической среды без урацила, добавляя 0,5 процента глюкозы до тех пор, пока оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет 1,8.

Индуцируйте экспрессию белка, добавив 2,8 процента галактозы в культуру, и продолжайте инкубацию в течение 18 часов при температуре 30 градусов Цельсия. Соберите дрожжевую суспензию центрифугированием при 3800 умноженных на G в течение десяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость после центрифугирования.

Повторно суспендируйте клетки в 50 миллилитрах буфера для лизиса EFL1 с добавлением одного миллимолярного PMSF и одного миллимолярного бензамидина. Разрушайте клетки трением о бисерную машину с использованием стеклянных шариков в течение шести минут, используя циклы по две минуты включения и пятнадцати минут выключения при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте образец при 9 000 умноженных на G в течение 50 минут при четырех градусах Цельсия.

Сохраните надосадочную жидкость и выбросьте небо, чтобы удалить клеточный мусор. Затем уравновесьте колонку сродства никеля с тремя объемами колонок буфера для лизиса EFL1. Внесите всю осветленную надосадочную жидкость в уравновешенную колонку.

После удаления несвязанного белка путем промывки колонки тремя объемами буфера для лизиса EFL1, элюируйте связанный белок тремя объемами колонки буфера для элюирования EFL1. Для дальнейшей очистки белка EFL1 уравновесьте колонку исключения размера с объемом 1,5 колонки буфера анизотропии. Сконцентрируйте белок EFL1, выведенный из колонки сродства никеля, до одного миллилитра с помощью ультрафильтрационных устройств путем центрифугирования при 3800-кратном G. Затем введите концентрированный образец в колонку исключения размера.

Соберите ускользающий белок и сконцентрируйте его с помощью ультрафильтрации до конечной концентрации около 30 микромоляров. Проверьте чистоту белка EFL1 с помощью анализа SDS-PAGE и окрашивания по Кумасси. Мгновенно заморозьте белок в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования.

Смешайте три наномоли белка SBDS-FlAsH с тремя наномолями зеленого красителя lumio в пятимикрометровом объеме буфера анизотропии. Дайте реакции протекать в течение восьми часов при температуре четыре градуса Цельсия. Через восемь часов диализуйте образец в буфере анизотропии на ночь, чтобы удалить свободный краситель.

Измерьте абсорбенты на глубине 280 нанометров и 508 нанометров в спектрофотометре с помощью кварцевой кюветы. Затем используйте закон Ламберта-Бира для количественной оценки процента меченого белка, как описано в текстовом протоколе. Перед измерением значения анизотрофии следует тщательно проводить каждый этап фильтрации из легиона белка, следя за тем, чтобы весь образец был дозирован в раствор и стал однородным.

Во флуоресцентную кювету поместите 200 микролитров 30 наномолярных SBDS-FlAsH в анизотрофный буфер и титруйте два микролитра 30 микромолярных EFL1. Тщательно перемешайте и дайте реакции постоять три минуты, прежде чем измерять значение анизотрофии и флуоресценции. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет добавлен общий объем EFL1 в 40 микролитров.

В качестве последнего шага подгоните данные под предполагаемую модель привязки, как описано в текстовом протоколе. Для проведения любого эксперимента по анизотрофии важно исключить большие изменения интенсивности флуоресценции. Как показано на рисунке, флуоресценция SBDS-FlAsH заметно не изменяется при связывании с EFL1.

Титрование EFL1 в кварцевую кювету, содержащую SBDS-FlAsH, приводит к увеличению исходной наблюдаемой анизотрофии. Несколько дополнений EFL1 описывают соответствующую кривую привязки, которая может быть аппроксимирована с помощью нелинейной регрессии по методу наименьших квадратов к предполагаемой модели связывания. В этом случае модель с одним сайтом связывания не позволяет адекватно описать экспериментальные данные.

Вместо этого модель двух неидентичных сайтов связывания адекватно описывает экспериментальные данные. После освоения эксперимент по связыванию флуоресцентной анизотрофии может быть проведен за три часа, если он выполнен правильно. При попытке этой процедуры важно иметь очищенный белок в больших количествах.

Параллельно с этой процедурой могут быть выполнены другие методы, подобные этому, с анализом комплементации на основе фрагментов или флуоресцентной анизотрофией с различными доменами изучаемого белка для поддержки соответствующей модели связывания. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить эксперимент по связыванию с последующей флуоресцентной анизотрофией.