Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Общая цель этого эксперимента заключается в выделении плазмоцитоидных дендритных клеток, или ПДК, с высокой степенью чистоты из костного мозга мышей, склонных к волчанке, для изучения их функции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с характеристиками конкретной популяции иммунных клеток, таких как продуцирование интерферона альфа PDC на поздней стадии развития волчанки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что от одной до нескольких целевых популяций могут быть обогащены до более высокой чистоты, чем с помощью магнитной сортировки шариков.

После сбора урожая переложите кости задних конечностей и четыре миллилитра полной среды в ступку. Добавьте шесть миллилитров свежей готовой среды, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров. И аккуратно разломайте косточки пестиком.

Аккуратно помешивайте пестиком, чтобы освободить костный мозг. Затем перелейте всю среду через ситечко 70 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров на льду. Добавьте в раствор 10 миллилитров свежей готовой среды.

И процедите надосадочную жидкость еще два раза, пока кости не станут белыми. Затем центрифугируйте клетки костного мозга и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежей готовой среды. Затем нанесите слой клеток на пять миллилитров свежеприготовленной градиентной среды плотности в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, стараясь не нарушить слои.

И разделить клетки путем центрифугирования. Затем осторожно удалите верхние восемь миллилитров раствора, а два миллилитра наберите охристый слой в промежутке фаз. Добавьте 12 миллилитров ледяной полной среды к изолированным мононуклеарным элементам и закройте пробирку для перемешивания методом инверсии.

Затем гранулируйте клетки центрифугированием. Чтобы окрашивать клетки для FACS, повторно суспендируйте их в 100 микролитрах CD1632FC блокирующего антитела при четырех градусах Цельсия. Через 10 минут промойте клетки в четырех миллилитрах ледяного сортировочного буфера и пометьте клетки 100 микролитрами соответствующего коктейля антител, окрашивающих клеточную поверхность.

В течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в темноте. Промойте клетки в четырех миллилитрах ледяного сортировочного буфера, чтобы удалить любые несвязанные флуоресцентные конъюгированные антитела. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах раствора для загрузки FACS и переложите образец в пробирку FACS на льду.

Для окрашивания компенсационного контроля необходимо использовать аликвоту один умножить на 10-шестую спленоциты на пробирку. Промойте ячейки четырьмя миллилитрами сортировочного буфера и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах сортировочного буфера. Затем добавьте соответствующее флуоресцентное сопряженное антитело из коктейля антител поверхности главной клетки в каждую соответствующую компенсационную пробирку и встряхните пробирки для смешивания.

Через 15 минут в темноте, при температуре четыре градуса Цельсия, промойте все образцы с помощью сортировочного буфера и снова суспендируйте гранулы в 500 микролитрах ледяного сортировочного буфера. За исключением трубки DAPI, которая повторно суспендирована в 500 микролитрах загрузочного раствора FACS. Для очистки популяции клеток-мишеней с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток загрузите пробирки для сбора, содержащие 500 микролитров FBS с добавлением антибиотиков, ниже сортировочных клапанов.

Затем загрузите неокрашенную трубку и соберите 10 000 событий, чтобы установить отрицательный вентиль для каждой интенсивности флуоресценции. И 10 000 событий в одиночных пробирках компенсации пятен для установки положительного затвора для каждой интенсивности флуоресценции. Соберите 3 000 событий из экспериментальной выборки, чтобы задать вентили отсортированной популяции клеток.

Использование интенсивностей флуоресценции в качестве параметров графика доступа по X и Y для ручного определения популяции клеток-мишеней. Затем отсортируйте целевую популяцию клеток в пробирку для сбора. В конце сортировки добавьте в ячейки до четырех миллилитров ледяной капусты в полном составе.

Затем закройте пробирку крышкой и перемешайте ячейки методом инверсии. Очистите очищенные клетки методом центрифугирования, отасунув все, кроме последних 200 микролитров надосадочной жидкости. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ледяной полной среды и перенесите ячейки в микроцентрифугу объемом 1,5 мл для второго центрифугирования.

Наконец, аспирируйте все, кроме последних 100 микролитров надосадочной жидкости, и храните отсортированную клеточную популяцию на льду до использования. Магнитно-активированная сортировка плазмоцитоидных дендритных клеток костного мозга мышей, склонных к волчанке, дает чистоту всего 7,75% после обогащения. Обогащенные FACS плазмоцитоидные дендритные клетки, однако, демонстрируют чистоту до 96,4% после сортировки.

Для обеспечения высокой чистоты мононуклеарные клетки костного мозга сначала затворяются и отделяются от мусора по параметрам прямого и бокового рассеяния. Используя зависимость ширины прямого рассеяния от высоты прямого рассеивания и ширину бокового рассеивания от высоты бокового рассеивания, отдельные ячейки дополнительно стробируются, чтобы избежать ложноположительных сигналов, производимых агрегатами. Затем живые одиночные DAPI-отрицательные клетки гейтируются их CD11c-положительной, CD11B негативной экспрессией клеточной поверхности, что позволяет в дальнейшем гейтировать B220-положительную, PDCA-1-положительную целевую популяцию плазмоцитоидных дендритных клеток костного мозга.

Отсортированная популяция PDC не только имеет высокую чистоту, но и функционально нормальна со способностью продуцировать IFNalpha при стимуляции CPG in vitro. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно хрустить кости и осторожно размешивать высвобожденный костный мозг, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование РНК или культивирование и стимуляция in vitro, чтобы ответить на дополнительные вопросы об экспрессии генов или функции обогащенных клеточных популяций.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям PDC к изучению роли этой мощной клетки в развитии мышиных моделей, склонных к волчанке. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить высокоочищенную популяцию PDC из костного мозга мышей, склонных к волчанке.