Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Общая цель данного эксперимента заключается в выделении плазмоцитоидных дендритных клеток (ПКДК) высокой степени чистоты из костного мозга мышей, предрасположенных к системной красной волчанке, для изучения их функций. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся характеристик конкретной популяции иммунных клеток, таких как ПКДК, продуцирующие интерферон альфа на поздней стадии развития волчанки. Основным преимуществом данной методики является возможность обогащения одной или нескольких целевых популяций до более высокой степени чистоты, чем при сортировке с помощью магнитных бусин.

После сбора образцов перенесите кости задних конечностей и 4 мл полной среды в ступку. Добавьте 6 мл свежей полной среды, чтобы общий объем составил 10 мл. Осторожно раздробите кости пестиком.

Осторожно перемешайте содержимое пестиком, чтобы высвободить костный мозг. Затем перенесите всю среду через сито с размером пор 70 micron в коническую пробирку объемом 50 milliliter на льду. Добавьте в ступку 10 milliliters свежей полной среды.

Отфильтруйте супернатант еще дважды, пока кости не станут белыми. Затем центрифугируйте клетки костного мозга и ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах свежей полной среды. После этого осторожно нанесите клетки на 5 миллилитров свежеприготовленной среды для градиентного центрифугирования в конической пробирке объемом 15 миллилитров, стараясь не нарушить целостность слоев.

Разделите клетки путем центрифугирования. Затем осторожно удалите верхние 8 мл раствора и соберите 2 мл лейкоцитарного слоя (buffy coat) на границе раздела фаз. Добавьте 12 мл ледяной полной среды к выделенным мононуклеарным клеткам и закройте пробирку крышкой, чтобы перемешать содержимое путем инверсии.

Затем осадите клетки путем центрифугирования. Для окрашивания клеток для FACS ресуспендируйте их в 100 µL блокирующего антитела CD1632FC при температуре 4 °C. Через 10 минут промойте клетки в 4 мл ледяного сортировочного буфера и пометьте их, добавив 100 µL соответствующего коктейля антител для окрашивания поверхности клеток.

Инкубируйте в течение 15 минут при температуре 4 °C в темноте. Промойте клетки в 4 мл ледяного сортингового буфера, чтобы удалить любой несвязавшийся конъюгированный флуоресцентный антитело. Затем ресуспендируйте осадок в 500 µL раствора для загрузки в FACS и перенесите образец в пробирку для FACS на льду.

Для окрашивания контролей компенсации распределите по пробиркам 1 × 10⁶ спленоцитов. Промойте клетки 4 мл сортировочного буфера и ресуспендируйте осадок в 100 мкл сортировочного буфера. Затем добавьте соответствующее конъюгированное с флуорохромом антитело из основного коктейля антител к клеточным поверхностным маркерам в каждую соответствующую пробирку для компенсации и встряхните пробирки для перемешивания.

После 15 минут выдержки в темноте при температуре 4 °C промойте все образцы сортировочным буфером и ресуспендируйте осадки в 500 µL ледяного сортировочного буфера. Исключение составляет пробирка с DAPI, которую ресуспендируют в 500 µL раствора для загрузки FACS. Для очистки целевой популяции клеток методом сортинга клеток с флуоресцентной активацией поместите под сортировочные клапаны пробирки для сбора, содержащие 500 µL FBS с добавлением антибиотиков.

Затем загрузите неокрашенную пробирку и соберите 10 000 событий, чтобы установить отрицательный гейт для каждой интенсивности флуоресценции. Также соберите по 10 000 событий в пробирках с одиночным окрашиванием для компенсации, чтобы установить положительный гейт для каждой интенсивности флуоресценции. Соберите 3 000 событий из экспериментального образца, чтобы установить гейты для популяции сортируемых клеток.

Используйте интенсивность флуоресценции в качестве параметров по осям X и Y графика для ручного выделения (гейтирования) целевой популяции клеток. Затем отсортируйте целевую популяцию клеток в пробирку для сбора. По завершении сортировки добавьте к клеткам до четырех миллилитров охлажденной на льду полной среды.

Затем закройте пробирку крышкой и перемешайте клетки путем инверсии. Осадите очищенные клетки центрифугированием, аспирировав весь супернатант, кроме последних 200 µL. Затем ресуспендируйте осадок в 1 mL ледяной полной среды и перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL для второго центрифугирования.

Наконец, аспирируйте весь супернатант, кроме последних 100 µL, и храните отсортированную популяцию клеток на льду до использования. Магнитная активация сортировки плазмоцитоидных дендритных клеток костного мозга мышей, предрасположенных к системной красной волчанке, приводит к чистоте всего 7,75% после обогащения. Однако плазмоцитоидные денритные клетки, обогащенные с помощью FACS, демонстрируют чистоту до 96,4% после сортировки.

Для обеспечения высокой чистоты мононуклеарные клетки костного мозга сначала выделяют с помощью гейтирования, отделяя их от клеточного дебриса по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Используя ширину прямого светорассеяния относительно его высоты, а также ширину бокового светорассеяния относительно его высоты, проводят дальнейшее гейтирование одиночных клеток, чтобы исключить ложноположительные сигналы, создаваемые агрегатами. Затем живые одиночные DAPI-отрицательные клетки отбирают по экспрессии поверхностных маркеров CD11c+ и CD11B-, что позволяет выделить целевую популяцию плазмоцитоидных дендритных клеток костного мозга, положительных по маркерам B220 и PDCA-1.

Отсортированная популяция PDC обладает не только высокой степенью чистоты, но и функциональной сохранностью, проявляющейся в способности вырабатывать IFNalpha при стимуляции CPG in vitro. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости разламывания костей и осторожного перемешивания высвобожденного костного мозга для сохранения жизнеспособности клеток. После завершения этого этапа могут быть применены другие методы, такие как секвенирование РНК или культивирование и стимуляция in vitro, для получения дополнительных данных об экспрессии генов или функциях обогащенных популяций клеток.

После разработки эта методика позволила исследователям PDC изучить роль этих мощных клеток в развитии волчанки и на моделях мышей, предрасположенных к волчанке. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделить высокоочищенную популяцию PDC из костного мозга мышей, предрасположенных к волчанке.