Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов

Общая цель этого подхода заключается в моделировании колонизации печени метастатическими опухолевыми клонами, генерируемыми колоректальным раком, и использовании этой модели для улучшения диагностики и терапии метастазов в печени. Клинические наблюдения указывают на гетерогенность метастатического заболевания. Наша модель обеспечивает возможность улавливать эту гетерогенность для обнаружения генов, связанных с олигометастатическим и полиметастатическим заболеванием.

И использовать эти знания для улучшения раннего выявления и лечения метастазов. Основное преимущество нашей методики заключается в том, что мы используем моноклональные клеточные линии с двойной меткой, полученные от пациентов с колоректальным раком, и можем наблюдать развитие метастазов в печени как in vivo, так и ex vivo. Применение этого метода распространяется и на терапию метастатического заболевания.

Это дает нам возможность тестировать любой потенциальный препарат с количественной оценкой количества метастатических поражений и кинетики роста каждого поражения. После получения меченых люциферазой клеток TDT116 и подготовки сред, реагентов и инструментов, в соответствии с текстовым протоколом, транспектированные клетки с следующей плотностью на лунку, в трех экземплярах, в 96-луночных планшетах. После инкубации клеток в течение пяти часов количественно измерьте интенсивность флуоресценции tdTomato с помощью системы IVIS, запустив программное обеспечение для обработки изображений на рабочем столе.

Нажмите кнопку Инициализировать для инициализации времени изображения, биннинг среды, два для F/Stop, 535 для фильтра возбуждения и 580 для фильтра излучения. Поместите 96-луночный планшет на станцию визуализации и нажмите «Получить», чтобы начать визуализацию. После получения изображения в палитре инструментов нажмите кнопку Инструменты ROI и выберите 12x8 на значке щели.

Создайте щели 12x8 для покрытия площади сигнала на изображении 96-луночной пластины и перейдите на вкладку Измерения. Посмотрите на окно с таблицей измерений ROI с единицами измерения фотонов в секунду, на стерадиан, на квадратный сантиметр. Как только клетки достигнут 70-80 процентов конфлюенции, примерно за час до инъекции селезенки, добавьте 0,05 процента трипцина и 0,53 миллимоляра ЭДТА в клетки, чтобы диссоциировать их.

После инкубации клеток в течение трех-пяти минут используйте равный объем C-DMEM для нейтрализации трипсина. Тщательно пипетируйте культуры, чтобы избежать комков, затем используйте автоматический счетчик клеток для подсчета клеток. Заморозьте взвешенные клетки в 1x DBPS в концентрации от 1,2 до 2 x 10 до 6 клеток на 100 микролитров, тщательно пипетируя во избежание комкования.

Затем держите клетки на льду до инъекции, время от времени повторно суспендируя их в трубке. После введения анальгетиков и обезболивания шести-восьминедельной самки атимической обнаженной мыши в соответствии с текстовым протоколом, определите селезенку как фиолетовую область, видимую снаружи через кожу на левом боку, и сделайте восьмимиллиметровый разрез левого бока на коже прямо над органом. Далее поднимите вверх брюшную стенку и сделайте небольшой разрез.

Впустите воздух в брюшную полость, чтобы внутренние органы отошли от места разреза. Затем увеличьте разрез брюшной стенки примерно до пяти миллиметров. Шаги, продемонстрированные для инъекции, имеют решающее значение для процедуры.

Утечка опухолевых клеток во время инъекции может привести к внепеченочным метастазам. Инъекция должна выполняться медленно, в течение 30-60 секунд, с использованием не более 1,5 миллионов клеток для предотвращения тромбоза портальных вен. Обнажите селезенку, используя ватный тампон, чтобы аккуратно надавить на разрез.

При необходимости можно мягко манипулировать панкреатическим жиром, чтобы не повредить селезенку. С помощью одномиллилитрового шприца с иглой 27-го калибра в течение 30-60 секунд введите 100 микролитров клеток в кончик обнаженной селезенки. В конце инъекции поместите микрозажим на селезенку перед удалением иглы, чтобы предотвратить утечку введенной клеточной суспензии, и оставьте ее на месте на пять минут.

Через пять минут после инъекции с помощью ручного устройства для прижигания выполните спленэктомию для гемостаза. Начните с ворот селезенки с передней стороны с предварительной коагуляции проксимальной стороны сосудов с прилегающей жировой тканью. В месте инъекции может возникнуть кровотечение из селезенки.

Микроклипса накладывается на селезенку для предотвращения утечки опухолевых клеток и для контроля кровотечения из селезенки. Методы гемостаза могут включать прижигание, удержание давления в течение трех-пяти минут и при необходимости наложение швов. Закройте брюшную стенку с помощью рассасывающегося плетеного шва 5.0 и одного горизонтального шва.

Затем используйте нерассасывающийся шов из мононити 4.0, чтобы закрыть кожу, также одним горизонтальным швом. Наблюдение за животным после операции, согласно текстовому протоколу. Для проведения биолюминесцентной визуализации, после обезболивания мышей согласно текстовому протоколу, внутрибрюшинно вводят животным 150 микролитров предварительно приготовленного люциферина для светлячков.

Поместите мышей в IVIS в лежачее положение с прокладками между животными, чтобы свести к минимуму сигнал для соседних мышей. Через три минуты после инъекции люциферина, после инициализации IVIS, выберите люминесцентность, время экспозиции в одну секунду и биннинг среды. Нажмите кнопку «Получить», чтобы начать визуализацию, гарантируя, что визуализация будет выполняться последовательно через три минуты после инъекции люциферина.

После того, как изображение получено и появится окно изображения и палитра инструментов, нажмите «Инструменты ROI» и выберите число от одного до пяти на круглом значке, которое соответствует количеству изображенных мышей. Чтобы определить ROI, обведите сигнальную область люминесцентного сигнала на брюшной полости мыши, а затем щелкните измерения ROI как произвольной единицы излучения. Добавьте дополнительный круг ROI для фона.

Через четыре недели после инъекции, чтобы провести диффузную люминесцентную томографию (DLIT), после инициализации IVIS выберите «Мастер визуализации», «Биолюминесценция» и нажмите «Далее». Выберите DLIT и нажмите Далее. Выберите Firefly Probes и нажмите Далее.

Выберите «Мышь» для объекта изображения, «Авто» для параметра экспозиции C-13 Centimeter для поля зрения и 0,5 сантиметра в качестве типа объекта и нажмите «Далее». Затем нажмите кнопку «Получить», чтобы начать создание образа. После получения изображения выберите вкладку Реконструкция DLIT 3D на вкладке Анализ и нажмите кнопку Реконструировать, чтобы создать изображение 3D-реконструкции.

Нажмите «Инструменты и 3D-анимация». Затем в окне «3D-анимация» выберите «Вращение CCW по оси Y». Нажмите «Запись и сохранение», чтобы сохранить файл в формате mov.

Чтобы провести флуоресцентную визуализацию ex vivo, после забора и препарирования печени мышей в соответствии с текстовым протоколом, измерьте интенсивность флуоресценции для каждой колонии опухоли с помощью IVIS. Выберите флуоресценцию, время экспозиции четыре секунды, биннинг среды, 2 для диафрагмы/ступени, 535 для фильтра возбуждения и 580 для фильтра излучения. Нажмите кнопку «Получить», чтобы начать создание образа.

После получения изображения найдите окно «Изображение» в палитре инструментов. Нажмите «Инструменты ROI» и выберите 1 из круглого значка. Чтобы определить ROI, обведите на изображении сигнальную область отдельных колоний опухолей.

Получите дополнительный круг ROI на фоне, а затем нажмите кнопку Измерения ROI как произвольной единицы излучения. Приобретите дополнительный круг ROI на фоне. Наконец, проведите расчеты по текстовому протоколу.

Как показано с помощью биолюминесценции, через три недели после введения селезенки клоны L2T HCT116 P1 и P2 имели большую опухолевую нагрузку по сравнению с клонами O1 и O2. Эти данные указывают на то, что клоны O1 и O2 могут имитировать олигометастатическое заболевание, в то время как P1 и P2 представляют собой агрессивную широко распространенную метастатическую колонизацию печени. Количественная оценка флуоресценции печени ex vivo по состоянию на четыре недели после инъекции селезенки подтвердила, что P1 и P2 имеют более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению с печенью O1 и O2. Флуоресцентное мечение опухолевых клонов позволило выявить количество и размеры отдельных метастатических колоний в печени.

В целом, флуоресцентные изображения ex vivo согласуются с макроскопическими данными, но небольшие колонии, скрытые под поверхностью, лучше обнаруживаются с помощью флуоресцентной визуализации. Как показано на рисунке, количество и размеры метастатических колоний были подсчитаны и измерены в каждой печени, а флуоресцентная визуализация ex vivo была проведена для каждой метастатической колонии для каждого моноклона. Как показано на этих графиках, общее количество метастазов в Р1 было выше по сравнению с Р2, О1 и О2, в то время как средний размер отдельных колоний был больше в Р2, чем в Р1, О1 и О2. Наша модель обеспечивает подход к выявлению новых генов убеждения, связанных с молекулярной гетерогенностью метастазирования.

Эти гены могут быть использованы в качестве мишеней для новых подходов к лечению метастазов. Наша модель также может быть использована для валидации различных белок-кодирующих и некодирующих генов, которые появляются из современных крупных клинических баз данных, но еще не функционально определены в контексте метастатического заболевания. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за деликатности операции на животных.

Однако с практикой хорошие результаты достигаются за короткий промежуток времени. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о соблюдении рекомендаций по хирургии животных, тщательно контролировать кровотечение и предотвращать утечку суспензии опухолевых клеток.