Микроглия как суррогатного биосенсора, чтобы определить наночастицу нейротоксичности

Общая цель данного протокола — описать in vitro суррогатный биосенсор для тестирования микроглиального ответа на наночастицы. Затем мы определим нейротоксичность после воздействия кондиционированных сред из микроглии, стимулированной наночастицами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как насколько активно наночастицы проверяются на нейротоксичность.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что наша модель обеспечивает возможность прямой активации микроглии и определения того, являются ли секретные факторы нейротоксинами, без использования дорогостоящих долгосрочных исследований на грызунах. Тем не менее, этот метод может дать представление об индуцированной микроглией гибели клеток после воздействия микрочастиц. Он также может быть применен к другим моделям нейродегенеративных заболеваний в контексте тестирования потенциальных нейротоксичных загрязнителей окружающей среды.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с этапом фильтрации фильтрующего материала. Потому что эффективность фильтрации может отличаться в зависимости от размера, формы и концентрации наночастиц. При приготовлении подогреваем DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSN до 37 градусов Цельсия.

Затем возьмите замороженные микроглиальные клетки BV2, полученные из пассажей 18-25, и быстро разморозьте их при 37 градусах Цельсия. Далее аккуратно переложите размороженные ячейки в вентилируемую колбу площадью 75 квадратных сантиметров, содержащую 10 миллилитров среды, и инкубируйте колбу. Через 24 часа замените среду и продолжайте выращивать клетки до тех пор, пока они не достигнут сливаемости 70-80%. На этом этапе аспирируйте среду и добавьте 500 микролитров теплого раствора трипсина ЭДТА.

Дав колбе поинкубироваться еще несколько минут, с помощью скребка соберите клетки в 5 миллилитров теплого DMEM. Затем отфильтруйте ячейки из колбы с помощью ситечка 70 мкм. Повторите эту фильтрацию три раза, используя одно и то же ситечко, и соберите ячейки в 50-миллилитровую пробирку.

После фильтрации подсчитайте клетки, а затем засейте пустынную пластину с черными стенками и 8000 клеток на лунку в 200 микролитрах дополненного DMEM. После 24 часов инкубации замените среду в лунках бессывороточным DMEM, чтобы лишить микроглию голодания. После еще 24 часов инкубации приступайте к активации микроглии.

Для этого сначала разведите наночастицы серебра в бессывороточном DMEM до желаемой рабочей концентрации. Затем замените 100 микролитров среды лечебным составом. Обязательно включите отрицательный контроль разбавленного автомобильного раствора без наночастиц.

Теперь продолжайте инкубацию в течение 24 часов и приступайте к анализу. Для начала соберите по 200 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки планшета и загрузите ее в фильтр, который удалит наночастицы, помещенные в микроцентрифужную пробирку. Важно помнить, что при фильтрации наночастиц их размер, форма и концентрация являются фактором эффективности термоядерного синтеза.

Поэтому желательно заранее протестировать фильтрацию. Теперь закрутите трубки при 14000 г при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем выбросьте проточный канал, который содержит наночастицы, и поместите фильтры вверх дном в новые пробирки для сбора.

Вращайте фильтры вверх дном при 1000г в течение двух минут, чтобы собрать концентрированную кондиционированную среду, содержащую цитокины. Далее увеличьте объем сбора до 400 микролитров с помощью свежеприготовленной добавки DMEM и храните тюбики на льду. Чтобы обеспечить удаление остаточных наночастиц серы из фильтруемого материала, приготовьте стандарты нефильтрованных наночастиц в диапазоне концентраций от холостого до 0,2 микрограмма на миллилитр в бессывороточном DMEM.

Затем 50 миллилитров отфильтрованных образцов и каждого стандарта помещают в черную прозрачную донную пластину и измеряют поглощение от 390 до 410 нанометров. Чтобы измерить концентрацию TNF-альфа в образцах, используйте половину их оставшегося объема в коммерчески доступном наборе. Для этого анализа устанавливают клетки гипоталамуса из замороженных запасов.

Использование тех же методов, которые описаны для создания микроглиальных культур. В конечном итоге используйте их для посева черностенных прозрачных донных пластин по 5000 клеток на лунку в 200 микролитрах дополненного DMEM. После 24 часов культивирования удалите 100 микролитров среды и замените ее 100 микролитрами отфильтрованной и концентрированной среды, собранной из активированных культур микроглиальных клеток, затем инкубируйте планшет в течение 24 часов в стандартных условиях.

На следующий день добавьте в каждую лунку по 22 микролитра реактива резазурина и продолжайте инкубацию в течение 20 минут. Затем с помощью многомодового спектрофотометра измерьте флуоресценцию для оценки жизнеспособности клеток в терминах относительных единиц флуоресценции. С помощью описанного протокола функция микроглии может быть использована в качестве суррогатного биосенсора для реакции мозга на наночастицы.

Секреция ФНО-альфа микроглией была значительно увеличена после воздействия щепочных наночастиц. Когда нейроны гипоталамуса подвергались воздействию кондиционированной среды из микроглии, активированной наночастицами серебра, жизнеспособность нейронов значительно снижалась. В принципе, воздействие наночастиц серебра активировало микроглию до провоспалительного состояния М1.

Затем высвобождаемые провоспалительные цитокины способствуют гибели окружающих клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать микроглию в качестве суррогатного биосенсора для тестирования реакции на наночастицы и является ли эта реакция нейротоксичной. После освоения этой техники ее можно выполнить за три или четыре дня, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как профилирование других секретируемых цитокинов после активации микроглии, с целью фенотипирования состояний активации микроглии.