Поступательный Администрация β-клеток митогенами к неповрежденной островки Mouse

Общая цель данного протокола заключается в использовании микросфер из поли(молочной-ко-гликолевой кислоты) или PLGA для доставки интересующих соединений в культивируемые интактные панкреатические островки с целью изучения влияния отдельных соединений на пролиферацию бета-клеток поджелудочной железы взрослых особей. Этот метод может быть использован для тестирования различных соединений, доставляемых локально с пролонгированным высвобождением в интактные островки. Основным преимуществом данного метода является возможность его легкой адаптации для других биоматериалов доставки, интересующих соединений и конечных анализов.

Данный метод также обладает потенциалом для доставки интересующих соединений одновременно с пересадкой островков in vivo. Процесс изготовления микросфер из PLGA продемонстрирует Тейлор Кавано, аспирантка моей лаборатории. Начните с добавления 1 mg флуоресцентно меченого интересующего соединения в 100 µL деионизированной воды для создания первой водной фазы.

Затем растворите 65 mg PLGA в 750 µL дихлорметана в scintillation vial и подвергните смесь ультразвуковой обработке в течение 10–30 секунд при мощности 160 W до полного растворения PLGA. Таким образом формируется масляная фаза. По каплям добавьте весь объем первой водной фазы в масляную фазу.

Затем с помощью ручного гомогенизатора эмульгируйте раствор при 20,000 rpm в течение 30 секунд, чтобы сформировать первую фазу «вода-в-масле». Затем по каплям добавьте всю первую фазу «вода-в-масле» в 15 мл 1% раствора PVA и проведите эмульгирование, как было показано ранее. Далее перенесите весь объем эмульсии в круглодонную колбу объемом 200 мл и с помощью роторного испарителя удалите растворитель для получения водной фазы при вакууме 635 мм рт ст в течение одного часа.

Перенесите по 1 мл водной фазы в каждую из 14 микроцентрифужных пробирок и осадите микросферы путем центрифугирования. После завершения центрифугирования с помощью микропипетки удалите 900 µL водного раствора из каждой пробирки, стараясь не задеть осадок. Промойте микросферы в 1 мл деионизированной воды, после чего осторожно удалите 900 µL супернатанта.

Затем добавьте 900 мкл деионизированной воды к оставшимся 100 мкл супернатантов. После этого кратковременно перемешайте на вортексе и подвергните воздействию ультразвука для ресуспендирования осадков. После выделения островков из островков интересующих экспериментальных животных перенесите 40 визуально сопоставимых по размеру островков в одну лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей в 200 мкл среды для культивирования островков.

На следующее утро ресуспендируйте одну аликвоту микросфер в среде для анализа так, чтобы конечная концентрация интересующего соединения в пробирке составляла 10 nanograms per microliter, и подвергните микросферы воздействию ультразвука в ледяной водяной бане в течение 10 минут при 160 watts с импульсами длительностью 10 second при температуре four degrees Celsius. Затем аккуратно удалите 100 microliters среды для культивирования островков из каждой лунки, не смещая островки, и инкубируйте культуры с 100 microliters среды для анализа, содержащей микросферы. Через три дня осторожно удалите среду для анализа из всех лунок, не затрагивая островки, и аккуратно промойте островки в 200 microliters PBS дважды.

Островки лишь слабо прикрепляются к 96-луночному планшету. Поэтому крайне важно осторожно удалять среду и PBS из каждой лунки, чтобы островки случайно не открепились и не были удалены. После второго промывания аккуратно погрузите островки в 100 µL раствора трипсина-ЭДТА на три минуты при комнатной температуре, выполнив осторожное пипетирование через две минуты.

Перенесите весь объем содержимого каждой лунки в отдельные микроцентрифужные пробирки и добавьте в каждую пробирку 400 µL среды для культивирования островков, чтобы остановить диссоциацию. После осаждения обработанных микросферами островков путем центрифугирования аккуратно удалите супернатанты с помощью микропипетки и ресуспендируйте осадки в 200 µL свежей среды для культивирования островков. Затем перенесите диссоциированные островки на заряженные предметные стекла с помощью цитоцентрифуги.

После высушивания на воздухе обведите островки гидрофобным маркером и зафиксируйте клетки в 75 microliters четырехпроцентного параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего дважды промойте их 75 microliters PBS. После второй промывки проведите пермеабилизацию клеток, добавив 75 microliters 0.2% Triton X-100 в PBS на 10 минут, с последующей финальной промывкой 75 microliters только PBS. Чтобы приступить к иммуномаркированию островков, поместите предметные стекла стороной с клетками вверх в увлажненную камеру и удалите PBS.

Затем заблокируйте неспецифическое связывание, добавив 75 µL нормальной сыворотки осла при комнатной температуре. Через один час замените сыворотку на 75 µL интересующих первичных антител и инкубируйте еще один час при комнатной температуре. По окончании инкубации аккуратно аспирируйте раствор первичных антител и промойте образцы, используя 375 µL PBS.

Затем инкубируйте островки с 75 мкл соответствующих вторичных антител с иммунофлуоресцентной меткой в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте. По окончании инкубации замените раствор вторичных антител на 75 мкл Dappy на три минуты, после чего промойте деионизированной водой в течение пяти минут. После промывки нанесите каплю раствора для заключения образцов объемом 100 мкл, содержащую быстросохнущий антифейдинговый реагент, на покровное стекло и переверните предметное стекло с образцом вниз, приложив его к раствору.

Наибольшая часть микросфер будет иметь диаметр от 1 до 10 микрон, хотя некоторые микросферы могут быть крупнее. После диспергирования островков, обработанных целыми микросферами из PLGA, и их последующего иммуномаркирования часто наблюдаются области образца между клетками, лишенные какой-либо метки; это вызвано наличием целых микросфер, которые не были полностью удалены в ходе этапов промывки. После получения изображений процент Ki67-положительных инсулин-положительных клеток можно количественно определить с помощью программного анализа изображений или путем ручного подсчета общего количества маркированных клеток.

Обработка неповрежденных островков микросферами из PLGA с рекомбинантным фактором роста соединительной ткани человека в течение трех дней, как было только что продемонстрировано, приводит к усилению пролиферации бета-клеток, что доказывает сохранение функциональности белка в процессе создания микросфер. После освоения данной методики при ее правильном выполнении можно получить результаты менее чем за одну неделю. При проведении этой процедуры важно помнить, что влияние на пролиферацию бета-клеток в вашем эксперименте будет варьироваться в зависимости от исследуемого соединения и точной кинетики высвобождения из созданных микросфер.

После выполнения данной процедуры можно применять другие методы, такие как котрансплантация нагруженных соединением микросфер вместе с целыми островками поджелудочной железы, чтобы ответить на другие вопросы, например, может ли интересующее соединение индуцировать пролиферацию бета-клеток in vivo. PLGA имеет историю применения в устройствах и системах доставки лекарственных средств, одобренных FDA, поэтому данный полимер является подходящим выбором для исследователей и клиницистов, стремящихся доставить терапевтический груз в определенные ткани в течение длительного периода времени. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать нагруженные соединением микросферы из PLGA и вводить их в культуру целых островков.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты.