Характеризуя переноса электронов через биоплёнки жизни

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы определить величину тока, которая может быть проведена через живой материал in situ, а также механизм, используемый живым материалом для переноса тока. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробной электрохимии, такие как: Как определенные биопленки могут перемещать электроны на сотни микрон для поддержки клеточного метаболизма? Основное преимущество этого метода заключается в том, что промежуточные электроды обеспечивают очень высокое отношение сигнал/шум и могут быть масштабированы для установки во множество различных конфигураций реакторов.

Эти методы могут дать представление о многоклеточном внеклеточном транспорте электронов в биопленках. Его также можно наносить на другие системы, такие как электропроводящие полимерные пленки. Исследователи, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он требует бипотенциостата для установки потенциалов обоих электродов отдельно и измерения тока на каждом электроде отдельно.

Для начала приобретите коммерчески доступные электроды IDA, структурированные на непроводящей подложке, или синтезируйте их с помощью стандартных литографических методов. Приготовьте проводящую серебряную эпоксидную смолу в соответствии с инструкциями производителя с помощью смесительного стержня или наконечника для пипетки. Затем поместите проволоку на каждую золотую прокладку и закрепите их на месте с помощью лабораторной ленты.

Покройте проволоку и прокладку серебряной эпоксидной смолой с помощью смесительного стержня или наконечника пипетки. Осторожно переместите аппарат в духовку с температурой 80 градусов Цельсия на один час для отверждения. После того, как эпоксидная смола затвердеет, используйте мультиметр, чтобы обеспечить электропроводность между концом провода и прокладками.

Сопротивление между проводом и колодками должно быть менее пяти Ом. Кроме того, используйте мультиметр, чтобы убедиться, что проводящая эпоксидная смола не соединяет несколько электродных контактов, так как это может привести к короткому замыканию массива. Если проводящая эпоксидная смола соединяет несколько проводов, используйте регистратор для изоляции проводов.

Затем снимите наконечник конической центрифужной трубки объемом 15 миллилитров, чтобы использовать ее в качестве формы для изоляционного материала. С помощью иглы 21 калибра сделайте два небольших отверстия в нижней части формы, через которые будут выступать провода. Вставьте IDA в форму и вставьте провода через отверстия в нижней части формы.

Далее подготовьте теплоизоляционный электро- и водонепроницаемый изоляционный материал. Часто подходят огнестойкие полиуретановые смолы. Поместите изолятор в форму с помощью пипетки так, чтобы серебряная эпоксидная смола была полностью покрыта, и дайте изолятору высохнуть в соответствии со спецификациями производителя.

Чтобы настроить электрохимическую ячейку, вставьте в электрохимическую ячейку IDA, противоэлектрод и электрод сравнения. Заполните электрохимическую ячейку стерильной средой, подходящей для роста биопленки. Для Geobacter sulfurreducens используйте пресноводную среду, исключая фумарат.

Далее подсоедините электроды к бипотенциостату. Подключите один электрод IDA к одному рабочему проводу, другой электрод IDA к двум рабочим проводам, электрод сравнения к ведущему сравнения, а противоэлектрод к счетчику. Проведите контрольный эксперимент, выполнив циклическую вольтамперометрию на первом электроде и удерживая второй электрод в разомкнутой цепи, чтобы убедиться, что электроды не соединены.

Чтобы вырастить соответствующую электроактивную биопленку, инокулируйте электрохимический реактор из исходной культуры или обогащения желаемыми электрохимически активными микроорганизмами с использованием стандартных асептических микробиологических методов. Для стандартных испытаний инокуляцию проводят в соотношении 1 к 20 от объема инокулюмента к реактору. Установите перемешивание в реакторе на нужный уровень и установите инкубатор или водяную баню на нужную температуру исходя из условий роста интересующей биопленки.

Инкубируйте систему в зависимости от конкретных требований интересующего микроорганизма до тех пор, пока биопленка не заполнит зазор, разделяющий два электрода. Для стационарной биопленки Geobacter sulfurreducens инкубируйте в течение семи-десяти дней при температуре 30 градусов Цельсия. Начните настройку экспериментальных параметров, которые будут использоваться для определения потенциальной зависимости тока для измерений стробирования, как описано в текстовом протоколе.

Настройте программное обеспечение bipotentiostat для выполнения измерений стробирования в выбранном диапазоне при выбранном напряжении стока источника и с желаемой скоростью сканирования. Кроме того, выполните базовое измерение, как описано в текстовом протоколе. Проводите измерения стробирования с использованием тех же условий при обороте с присутствующим в необороте донором или акцептором растворимых электронов без условий донора или акцептора растворимых электронов.

Приобретите управляющий реактор, чтобы убедиться, что заданное значение и фактическая температура среды одинаковы. Поместите термометр или термопару в контрольный реактор там, где будет находиться IDA. Затем произведите измерения тока деформации источника в диапазоне температур, выбранных в условиях оборота и без него, с помощью бипотенциостата.

Для этого установите и удерживайте IDA на потенциале затвора, который дает максимальный проводимый ток с помощью бипотенциостата. Регистрируйте максимальный проводимый ток с помощью бипотенциостата во время циклического переключения температуры между диапазоном температур, выбранным с помощью встроенных органов управления водяной бани или инкубатора. Переключайте температуру от одного заданного значения к другому и обратно с помощью встроенных органов управления инкубатора или водяной бани.

Это определяет обратимость реакции, чтобы гарантировать, что температурный цикл не нанесет вреда биопленке. Наконец, сбросьте температуру до нормальной температуры роста и дайте системе стабилизироваться. Здесь представлены репрезентативные результаты IDA, который правильно функционирует в пресноводной среде.

В отличие от той, где электроды были закорочены. Репрезентативные электрохимические измерения стробирования, выполненные на биопленке Geobacter sulfurreducens в условиях отсутствия оборота с напряжением источника 10 милливольт, демонстрируют пиковую кривую зависимости проводимого тока от потенциала затвора, характерную для окислительно-восстановительной проводимости. Здесь репрезентативные исходные данные показывают зависимость проводимого тока от температуры среды реактора.

Уменьшение проводимого тока с понижением температуры является еще одной характеристикой окислительно-восстановительных проводников. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за два дня, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что полосы IDA не закорочены перед инокуляцией реактора.

Применение этого метода распространяется и на терапию при изучении того, как нарушить клеточный метаболизм биопленкообразующих патогенов. Эта процедура может быть применена к любому живому материалу, способному транспортировать электроны, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как корреляция между рефологией биопленки и проводимостью.