Метод для измерения РНК N 6 -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

Общая цель модифицированного метода северного блоттинга заключается в измерении модификаций N6-метиладенозина, n6A в РНК и обнаружении модификаций в различных РНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли эпигенетики РНК, таких как модификации N6-метиладенозина. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает эффективное разделение РНК, лучшую стандартизацию для экспериментальных дизайнов и четкое разграничение модификации n6A в РНК.

Этот метод может дать представление о модификациях n6A в РНК, а также может быть применен к другим модификациям РНК с различными антителами к обнаружению. Чтобы начать эксперимент, распылите раствор обеззараживания рибонуклеазы на бумажные полотенца и протрите пипетки и поверхности лабораторного стола. Смочите бумажные полотенца водой, не содержащей нуклеаз, и снова протрите пипетки и поверхности лабораторного стола.

Получите раствор для выделения РНК, поддерживаемый при температуре четыре градуса Цельсия, и добавьте один миллилитр раствора примерно в 75 миллиграммов ткани мыши. Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации ткани. Далее добавьте 100 микролитров 1-Бромо-3-хлорпропана или БЦП на один миллилитр образца гомогената.

Энергично встряхивайте пробирки в течение 15 секунд и приступайте к полному выделению РНК. С помощью спектрофотометра определите концентрацию РНК, отметив поглощение на 260 нанометрах и 280 нанометрах. Проверьте качество образца РНК, выполнив электрофорез в 0,8%-ном агарозном геле.

Промойте все оборудование для электрофореза диэтилпирокарбонатом или водой DEPC. Соедините 2,5 грамма агарозы, затем 215 миллилитров воды DEPC в колбе Эрленмейера и полностью растопите смесь в микроволновой печи. После того как раствор растает, добавьте 12,5 миллилитров 10X MOPS буфера.

И 22,5 миллилитров 37% формальдегида в колбу. Затем налейте раствор в аппарат для электрофореза с помощью гребня толщиной 1,5 миллиметра. С помощью чистой расчески подтолкните пузырьки к краям геля.

Дайте гелю застыть при комнатной температуре. Далее с помощью заранее подготовленного бегового буфера 1X MOPS промыть лунки геля и предварительно запустить гель. Загрузите образцы РНК в лунки геля, затем запустите гель.

На следующий день осмотрите и сфотографируйте гель под ультрафиолетовым светом. Чтобы приготовить перенос, разрежьте гель и удалите неиспользованную порцию. Приготовьте 500 миллилитров 10X физиологического цитрата натрия или буфера SSC.

Смойте гель дважды с 10-кратным буфером SSC. Отрежьте один лист фильтровальной бумаги достаточно большим, чтобы покрыть гель. Отрежьте четыре листа фильтровальной бумаги до того же размера, что и гель.

Далее отрежьте один лист положительно заряженной нейлоновой мембраны до того же размера, что и гель. Отметьте выемку на геле, а также на мембране, как маркер, чтобы обеспечить правильную ориентацию. Замочите мембрану в буфере 2X SSC.

Налейте 500 миллилитров 10X SSC буфера в лоток для перевода. Положите большой лист фильтровальной бумаги на стеклянную пластину и смочите фильтровальную бумагу с помощью буфера для переноса. Затем с помощью пипетки раскатайте любые пузырьки.

Смочите два куска предварительно нарезанной фильтровальной бумаги в буфере для переноса и поместите их в центр фильтровальной бумаги. Удалите все пузыри. Затем положите гель верхней стороной вниз на фильтровальную бумагу и положите мембрану поверх геля, обязательно совместив выемки геля и мембраны.

Далее положите поверх мембраны два листа предварительно нарезанной фильтровальной бумаги. Удалите пузыри между слоями. Наложите полиэтиленовую пленку на гель, чтобы полотенца впитывали только буфер, проходящий через гель и мембрану.

Затем уложите поверх фильтровальной бумаги бумажные полотенца. Положите большую стеклянную тарелку поверх полотенец, а сверху на стопку положите груз и дайте РНК переместиться из геля на мембрану в течение ночи. После переноса держите мембрану влажной в буфере 2X SSC.

Погрузите два листа фильтровальной бумаги в буфер 10X SSC, затем поместите листы в УФ-сшиватель. Убедитесь, что поглощенная РНК сторона обращена вверх, затем поместите мембрану поверх фильтровальной бумаги. Выберите режим автоматического сшивания и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать облучение.

Исследуйте мембрану и гель с помощью УФ-улавливателя изображений геля, чтобы подтвердить перенос РНК от геля к мембране. Заблокируйте мембрану в 5% обезжиренном молоке в буфере TBST при комнатной температуре на один час. Инкубируйте мембрану в течение ночи в растворе антитела м6А при четырех градусах Цельсия.

На следующий день промойте мембрану трижды буфером TBST в течение 15 минут. Далее инкубируйте мембрану в конъюгированном растворе антител осла осла в течение одного часа при комнатной температуре. Через час трижды промойте мембрану буфером TBST в течение 15 минут.

Нанесите усиленную хемилюминесцентную подложку. Захватите хемилюминесценцию с помощью цифрового тепловизора. Наконец, перейдем к количественному определению m6A и измерим относительную интенсивность хемилюминесценции m6A с помощью изображения J.Mouse РНК печени мыши были отобраны с интервалом в четыре часа и изучены с помощью модифицированной техники северного блоттинга.

Метилирование рРНК, мРНК и малых РНК было четко обнаружено. Репрезентативные блоттинги m6A проводились для общей РНК и без рРНК из печени мышей дикого типа. После освоения этой техники ее можно сделать за четыре дня, если она выполнена правильно.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эпигенетики РНК к изучению влияния на физиологию человека, связанного с циркадным ритмом и ожирением.