ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.Y.W. получил поддержку от Национального научно-исследовательского института здравоохранения (NHRI-EX101-9925SC), Национального научного совета (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) и Мемориальной больницы Чанг Гунг (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 и CMRPG3C1763).

Примечание: Общую РНК м 6 Уровень включает рРНК, мРНК и другие малые РНК. Так как рибосомальной РНК имеет обильные м 6 модификаций А, измерение м 6 уровней А необходимо будет рассмотреть этот факт. Выделение 1. РНК <ol><li> Используя решение рибонуклеазы дезактивации (разбрызгивают на бумажные полотенца), протрите пипеток и лабораторного стола поверхности. Влажные бумажные полотенца с нуклеазы без воды и протирать пипеток и лабораторного стола поверхности снова. </li><li> Экстракция РНК <ol><li> Общая Выделение РНК <ol><li> С помощью верхней мешалки, гомогенизируют 50-100 мг ткани или 5-10 х 10 6 клеток в 1 мл раствора для выделения РНК выдерживали при 4 ° С. Примечание: больше ткани (100-150 мг), которые могут потребоваться для образцов жировой ткани мышей из-за более низкой концентрации РНК в них. Образцы получены из сердца мыши, печени, скелетных мышцах, легких, головного мозга, и макрофаги были использованы ранее 4. </li><li> Вcubate выборочные гомогенатов в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Добавляют 100 мкл 1-бром-3-хлорпропана (БКП) на 1 мл образца гомогената. Встряхнуть пробирки энергично в течение 15 секунд и приступить к изоляции общей РНК в соответствии с инструкциями изготовителя 24. </li></ol></li><li> Полиаденилированная мРНК Очистка от изолированной Общую РНК <ol><li> Очищают Полиаденилированная мРНК с использованием доступных наборов или протоколов. <ol><li> Тщательно взболтать, чтобы вновь приостановить каждое из следующих решений: 2x связывающего раствора, олиго (дТ) полистирольные шарики и промывочный раствор. Убедитесь, что олиго (дТ) бусин нагреться до комнатной температуры перед использованием. </li><li> Перенести 120 мкл элюирующего раствора на препарата в пробирку и нагревают до 70 ° С в нагревательном блоке. </li><li> Пипетировать до 500 мкг общей РНК в микроцентрифужных трубки. С помощью нуклеазы без воды, регулировать громкость до 250 мкл. </li><li> Добавьте 250 мкл раствора связывающего 2x до полной РНК, таклюция и вихрь коротко перемешать содержимое. </li><li> Добавьте 15 мкл олиго (дТ) бусы и вихрь тщательно перемешать. </li><li> Выдержите смесь при температуре 70 ° С в течение 3 мин. </li><li> Извлеките образец из нагревательного блока и дать постоять при комнатной температуре в течение 10 мин. </li><li> Центрифуга при 15000 мкг в течение 2 мин. </li><li> Осторожно удалите супернатант, оставляя позади приблизительно 50 мкл. </li><li> Добавьте 500 мкл промывочного раствора повторно приостанавливать осадок пипетированием. </li><li> Пипетировать суспензии в набор спинового фильтра / сбора трубки. </li><li> Центрифуга при 15000 мкг в течение 2 мин. Удалить столбец из коллекторной трубки и отбросить проточные. Вернуть колонку в пробирку. </li><li> Пипетка 500 мкл промывочного раствора на спиновый фильтр. </li><li> Центрифуга при 15000 х г в течение 2 мин. </li><li> Перенести спиновый фильтр в новую пробирку для сбора. </li><li> Пипетка 50 мкл элюирующего раствора нагреваютдо 70 ° С на центр спинового фильтра. </li><li> Выдержите в течение 2-5 мин при температуре 70 ° С. Центрифуга при 15000 мкг в течение 1 мин. </li><li> Пипетировать дополнительно 50 мкл элюирующего раствора нагревают до 70 ° С на центр спинового фильтра. </li><li> Повторите шаг 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Добавить 100 мкг / мл гликогена, 0,1 объема 3 М буфере ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объема абсолютного этанола. Осадок в течение ночи при -80 ° С. </li><li> Центрифуга при 15000 х г в течение 25 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант. </li><li> Промывают осадок с 1 мл 75% -ного этанола. Центрифуга при 15000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите этанол. </li><li> Сушить в воздухе в течение 3-5 мин. </li><li> Добавьте 10 мкл нуклеазы без воды, чтобы растворить осадок. </li><li> Хранить при температуре -70 ° С. </li></ol></li></ol></li><li> РНК Квалификация и Количественная <ol><li> С помощью спектрофотометра, определяют концентрацию РНК в присутствии NotIнг оптическую плотность при длине волны 260 нм и 280 нм. Отношение А 260 / А 280 должно быть 1,8-2,2. </li><li> Проверка качества образцов РНК с использованием 0,8% агарозном геле 25. ПРИМЕЧАНИЕ: неповрежденными эукариотической суммарную РНК должны показать интенсивные полосы 28S и 18S рРНК. Отношение 28S в сравнении интенсивности полос 18S рРНК для хорошей подготовки РНК составляет ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. Гель электрофорез и передачи Примечание: Протоколы подготовки буфера приведены в таблице 1. <ol><li> Формальдегид гель Приготовление (1%) <ol><li> Промыть все оборудование электрофорез с диэтилпирокарбонатом (DEPC) водой. </li><li> Melt 2,5 г агарозы в 215 мл воды DEPC полностью в микроволновой печи. </li><li> Добавить 12,5 мл 10х 3- (N - морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS) буфер и 22,5 мл 37% -ного формальдегида. </li><li> Налейте его в аппарате для электрофореза с толстым гребнем 1,5 мм. </li><li> Устранить пузырьки или толкать трубчик к краям геля с чистым гребнем. </li><li> Дайте гель затвердеть при комнатной температуре. </li></ol></li><li> Базовые приготовления <ol><li> Смешайте 1-10 мкг общей РНК и 11,3 мкл буфера для образцов. </li><li> Смешайте 2 мкг РНК-маркера (1 мкг / мкл) 11,3 мкл буфера для образцов. </li><li> Добавить нуклеазы без воды к образцам из 2.2.1, 2.2.2 до общего объема 16 мкл. </li><li> Нагревают при 60 ° С в течение 5 минут, а затем охладить на льду. </li><li> Смешайте 16 мкл образца из 2.2.3 с 4 мкл отслеживания красителя, который содержит 0,1 мкг / мкл этидийбромид на льду. ВНИМАНИЕ: этидий бромид, возможно, тератогенным и токсичен при вдыхании. Read этидий бромид технический паспорт безопасности. </li></ol></li><li> электрофорез <ol><li> Добавить 200 мл 10х MOPS буфера до 1800 мл DDH 2 O , чтобы сделать 1x MOPS работает буфера. </li><li> Используйте 1x MOPS работает буфера для промывки лунок геля. </li><li> Предварительно запуск тон гель при 20 В в течение 5 мин. </li><li> Загрузка образцов РНК в лунки геля. </li><li> Покрытие с фольгой, чтобы избежать попадания света. Запуск на 35 В в течение приблизительно 17 ч (в течение ночи) </li><li> Осмотрите и сфотографируйте гель под УФ-светом. </li></ol></li><li> Перевод <ol><li> Вырезать гель для удаления неиспользованную часть. </li><li> Приготовьте 500 мл 10х SSC-буфере (250 мл 20x SSC буфера и 250 мл DEPC воды). </li><li> Вымойте гель дважды с 10-кратным SSC буфером в течение 20 мин при встряхивании при 50 оборотах в минуту. </li><li> Вырезать 1 бумажный фильтр лист , достаточно большой , чтобы служить в качестве фитиля бумаги, впитывающей буфера переноса с передающего лотка (рисунок 1). </li><li> Вырезать 4 куска фильтровальной бумаги такого же размера, что и гель. </li><li> Порезать 1 лист положительно заряженную нейлоновую мембрану в тот же размер, что и гель. </li><li> Отметить насечку на геле и мембрану в качестве маркера, чтобы обеспечить правильную ориентацию. </li><li> Замочите мембрану в 2х буфера SSC ​​в течение 15 мин. </li><li> Залить 500 мл оF 10x SSC буфера в передаточную лоток. </li><li> Положите большой фильтр бумажного листа через стеклянную пластину и смочить фильтровальную бумагу буфера переноса. </li><li> Раскатать все пузырьки с пипеткой. </li><li> Замочить 2 куска фильтровальной бумаги предварительно вырезанное в буфере передачи и поместить их в центр фильтровальной бумаги со стадии 2.4.5. Удалите все пузырьки. </li><li> Уложить гель верхняя сторона была обращена вниз на фильтровальную бумагу. </li><li> Lay мембрану поверх геля. Совместите вырезы геля и мембраны. </li><li> Поместите 2 куска фильтровальной бумаги предварительно вырезанное на верхней стороне мембраны и смочить фильтровальную бумагу буфера переноса. </li><li> Удалите все пузырьки между слоями. </li><li> Нанести пластмассовую обертку вокруг геля, чтобы гарантировать, что полотенца только впитывать буфер, проходящий через гель и мембрану. </li><li> Стек бумажные полотенца на верхней части фильтровальной бумаги. </li><li> Поместите негабаритный стеклянную пластину поверх полотенца. </li><li> Поместите вес на верхней части стека. </li><li>Держите в течение ночи, чтобы позволить РНК перенести из геля на мембрану. </li></ol></li></ol> 3. Обнаружение N 6 -methyladenosine <ol><li> Мембрана Сшивание <ol><li> Держите мембрану влажной в буфер 2x SSC. </li><li> Поместите 2 листа фильтровальной бумаги, погруженной с 10x SSC буфером в УФ сшивателя. </li><li> Поместите мембрану в верхней части фильтровальной бумаги, чтобы сторона с РНК-адсорбированной лицевой стороной вверх. </li><li> Выберите режим &quot;autocrosslink&quot; (120000 мкДж) и нажмите кнопку &quot;Пуск&quot;, чтобы начать облучение. </li><li> Осмотрите мембрану и гель с УФ-уловителя изображение геля, чтобы подтвердить перевод РНК из геля на мембрану. </li></ol></li><li> иммуноблоттинг <ol><li> Блок мембраны в 5% молоке обезжиренном в Трис-буферном солевом растворе с Tween 20 (TBST) буфере при комнатной температуре в течение 1 часа. </li><li> Промыть трижды TBST буфером в течение 15 мин. </li><li> Выдержите в течение ночи в мембрану м 6 А (&lt;EM&gt; N 6 -methyladenosine) раствор антитела (1: 1000 в 5% обезжиренное молоко TBST буфер) при 4 ° С. </li><li> Промывают мембрану трижды TBST буфером в течение 15 мин. </li><li> Инкубируйте мембраны в растворе конъюгированным с пероксидазой хрена ослиного антителам кролика (1: 2000 в 5% обезжиренном буфера молока TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре. </li><li> Промывают мембрану трижды TBST буфером в течение 15 мин. </li><li> Примените расширенный хемилюминесцентный субстрат (0,125 мл на см 2 мембраны). </li><li> Захват хемилюминесценции с оптимальными настройками цифрового формирования изображений, в соответствии с инструкциями изготовителя 26. </li></ol></li><li> м 6 A Количественное <ol><li> Измерьте относительную м 6 хемилюминесцентный интенсивности с использованием программного обеспечения ImageJ. <ol><li> В меню программного обеспечения ImageJ, выберите опцию &quot;Файл&quot;, чтобы открыть соответствующую файл. </li><li> Выберите &quot;Прямоугольник&quot; инструмент из ImageJ и нарисуйте рамку вокругсигналы. </li><li> Если рибосомной РНК не является предметом экспериментов, избежать полос 18S и 28S рРНК м 6 А для расчета. </li><li> Нажмите кнопку &quot;Command&quot; и &quot;1&quot;, чтобы подтвердить выбранную полосу. </li><li> Нажмите кнопку &quot;Command&quot; и &quot;3&quot;, чтобы показать выбранный участок. </li><li> Нажмите на &quot;прямой&quot; инструмент и рисовать линии, чтобы отделить сегментированный область. </li><li> Нажмите кнопку &quot;Wand&quot; инструмент для записи измерений. </li><li> Экспорт данных. </li><li> Нормализовать уровень м 6 А с 18S рибосомальной РНК из группы окрашивания бромистым этидием. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li>
<li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+epitranscriptome%3A+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyl-adenosine+%28m6A%29+in+RNA%3A+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li>
<li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , SREP18874 (2016).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li>
<li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adenine+Code+for+DNA%3A+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+m%286%29A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li>
<li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA%3A+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucleic+Acid+Res+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li>
<li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+%28HRM%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874(2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li>
<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Модификации РНК играют важную роль в клеточной функции и физиологии. Современное понимание регуляции, функции и гомеостаза этих модификаций все еще изучается и расширяется8. Таким образом, необходим точный и отвечающий золотому стандарту метод оценки модификаций РНК. Модифицированный метод северного блоттинга обеспечивает точную количественную оценку модификаций РНК и четкое разграничение модификаций в различных РНК. Несмотря на то, что метод требует не менее 3 дней, он может быть стандартизирован и может использоваться в различных экспериментальных конструкциях. Более того, при наличии различных антител он может обнаруживать различные модификации РНК27.
При анализе модификаций РНК важно разделять разные РНК. Рибосомальная РНК составляет большую часть от общего количества РНК28,29. Результаты анализа модификаций РНК только в общей РНК будут представлять в основном изменения рРНК. Метилирование и другие подобные модификации рРНК потенциально могут маскировать изменения в других РНК. С помощью процедуры разделения геля можно более точно проанализировать модификации мРНК и других малых РНК.
Полнотранскриптомного картирование с помощью иммунопреципитации и секвенирования m6A дает подробное представление о модификации каждого типа РНК22. Он предоставляет информацию о конкретных РНК и разрешении около 80-120.о. Несмотря на то, что m6A-Seq может сравнивать модификации в различных экспериментальных условиях, выбор надлежащих стандартов и средств контроля для таких экспериментовзатруднен. Иммунопреципитацию трудно воспроизвести, что часто приводит к значительным вариациям между повторами. Кроме того, m6A-Seq требует фрагментации образцов РНК перед иммунопреципитацией и секвенированием30. Процесс фрагментации потенциально может вызвать чрезмерное влияние на исходные модификации РНК. Если эксперимент не нуждается в информации о конкретном гене, но требует других условий для сравнения, текущий метод обеспечивает лучшую визуализацию и контроль для различных экспериментальных установок. 
Модификация РНК является важным шагом в регуляции транскрипционного контроля31. Тем не менее, гомеостаз и регуляторные механизмы различных модификаций РНК в различных физиологических областях до сих пор неясны. Используя настоящий модифицированный метод северного блоттинга, можно количественно оценить и сравнить различные модификации РНК. Кроме того, можно более подробно исследовать изменения и регуляцию модификаций РНК. В будущем также станет возможным объединить экспериментальные данные как классического северного блоттинга, так и модифицированного протокола северного блоттинга, что обеспечит более глубокое понимание биологии РНК.
Наиболее важным фактором, определяющим успех модифицированного протокола северного блоттинга, является целостность образца РНК. РНК с некоторой степенью деградации могут давать хорошие результаты классического северного блоттинга, но это потенциально может оказать значительное влияние на результаты модифицированного северного блоттинга. Модификации РНК в различных тканях или клеточных линиях также могут значительно различаться. Перед проведением заключительных экспериментов важно протестировать подходящие загрузки образцов РНК для различных тканей.
Поскольку процедуры блоттинга традиционно назывались в честь доктора Саузерна и различных географических направлений, мы предлагаем название «северо-восточный» блоттинг для текущей техники.

Динамические и обратимые модификации РНК играют важную роль в гомеостазе РНК. Четыре десятилетия назад было обнаружено, что модификацииN-6-метиладенозина (m 6 A) в изобилии присутствуют в эукариотических транскриптомах 1. Они выполняют различные функции в матричной РНК (мРНК), рибосомной РНК (рРНК), малых ядрышковых РНК, транспортной РНК и микроРНК2. Модификации мРНК m6A влияют на их сплайсинг3, трансляцию4, деградацию5 и локализацию2. Кроме того, они влияют на биогенез рибосом и функцию микроРНК6. Эволюционная консервация модификаций РНК m6A отмечена у одноклеточных бактерий до многоклеточного человека7. Разграничение ролей модификаций m6A в настоящее время находится в стадии обширной проработки. Ожидается, что эти усилия позволят получить новое представление о контроле транскрипции. Недавние исследования показывают, что другие химические модификации мРНК8 также играют важную роль в метаболизме РНК. 
Циркадные ритмы9, плюрипотентность стволовых клеток10, метаболизм триглицеридов4, фиброз11, ожирение12 и большая депрессия13 - вот несколько примеров процессов, в которых, как известно, модификации m6A контролируют исходы. Многие транскрипты генов циркадных часов имеют m6A сайтов14. Модуляция метилазы или деметилазы m6A вызывает изменения циркадного периода15. Mettl3,m6A трансфераза, является регулятором плюрипотентности стволовых клеток. Дефицит Mettl3 приводит к ранней эмбриональной летальности и аберрантному праймингу линии на10-й стадии постимплантации. Дефицит жировой массы и связанного с ожирением (FTO), деметилазы m6A, в адипоцитах влияет на мобилизацию жирных кислот и массу тела через посттранскрипционную регуляцию Angptl44. Эти исследования показывают, что m6A не только контролирует процессинг мРНК, но и играет важную роль в эмбриологическом развитии и патофизиологии. Функция модификаций m6A имеет значение для терапевтических соображений в будущем.
Существует несколько методов измерения модификаций m6A РНК16-18. Традиционно для изучения распределения m6A в нескольких РНК используют тонкослойную хроматографию (ТСХ) и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)19,20. Масс-спектрометрия является чувствительным инструментом для обнаружения модификаций m6A в РНК. Тем не менее, РНК должна быть вырезана РНКазой на короткие фрагменты перед анализом с помощью масс-спектрометрии21. Иммунопреципитация и секвенирование метил-РНК (m6A-Seq)22 иммунопреципитает фрагментированные РНКm6A-специфическими антителами и выполняет параллельное секвенирование РНК. Этот метод генерирует ландшафты m6А шириной в транскриптом. Картирование с высоким разрешением сшивки и иммунопреципитации с индивидуальным нуклеотидным разрешением m6A (miCLIP) дополнительно картирует модификации m6A с однонуклеотидным разрешением23. Оба метода предоставляют подробную информацию о модификации m6A по всему транскриптому с информацией о конкретных генах. Однако количественная оценка и стандартизация в обоих методах затруднены, если эксперименты требуют сравнения нескольких условий. Кроме того, фрагментация РНК для m6A-Seq изменяет исходную структуру РНК, что может влиять на нативные уровни m6A. Для обнаружения глобальных модификацийm6A РНК и их изменений в различных экспериментальных условиях мы описали метод, в котором используется модифицированный протокол северного блоттинга. Этот метод разрешает РНК по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза18. Эта процедура обеспечивает лучшую стандартизацию и количественную оценку для экспериментов, включающих несколько условий или образцов. Он также предоставляет специфическую информацию о модификацииm6A для различных РНК, будь то рРНК, мРНК или микроРНК.

<table><tbody><tr><td>РНКазеЗап раствор</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Протокол 1.1</td></tr><tr><td>TRI Раствор реагента</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Протокол 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Бромо-3-хлорпропан (БЦП)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Протокол 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Этанол</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Протокол 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Изопропанол</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Протокол 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Протокол 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Гликоген</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Протокол 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Ацетат натрия</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Протокол 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Вода без нуклеазы</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Протокол 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Протокол 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Протокол 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Протокол 2.1.3</td></tr><tr><td>37% раствор формальдегида</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Протокол 2.1.3</td></tr><tr><td>ЭДТА, Динатриевая соль</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Протокол 2.1.3 10x MOPS буферная</td></tr><tr><td>формамид</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Протокол 2.2.1</td></tr><tr><td>РНК Маркер тысячелетия</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Протокол 2.2.2</td></tr><tr><td>Бромид этидия</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Протокол 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Протокол 2.2.5 Краситель для слежения</td></tr><tr><td>Бромфенол синий</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Протокол 2.2.5 Краситель для слежения</td></tr><tr><td>Ксилол Цианол FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Протокол 2.2.5 Краситель для слежения</td></tr><tr><td>Дигидрат хлорида натрия</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Протокол 2.4.2 20x SSC буфер</td></tr><tr><td>Тринатрий цитрат</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Протокол 2.4.2 20x SSC буфер</td></tr><tr><td>Hybond Blotting Paper</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>Протокол 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ мембрана</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>Протокол 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Стратаген</td><td>400075</td><td>Протокол 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>ANT Technology</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocol 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-метиладенозин)</td><td>Synaptic Systems</td><td>202003</td><td>Protocol 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-rabbit IgG, HRP-связанный целый Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protocol 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>протокол 3.2.8</td></tr></tbody></table>

Метод для измерения РНК<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Модификации РНК N 6-Methyladenosine (m6A) разнообразны и повсеместно распространены среди эукариот. Они встречаются в мРНК, рРНК, тРНК и микроРНК. Недавние исследования показали, что эти обратимые модификации РНК влияют на сплайсинг, трансляцию, деградацию и локализацию РНК. Многочисленные физиологические процессы, такие как циркадные ритмы, плюрипотентность стволовых клеток, фиброз, метаболизм триглицеридов и ожирение, также контролируются модификациямиm6A. Иммунопреципитация/секвенирование, масс-спектрометрия и модифицированный северный блоттинг являются одними из методов, обычно используемых для измерения модификацийm6A. В данной работе мы представляем метод северо-восточного блоттинга для измерения модификаций m6A. Текущий протокол обеспечивает хорошее разделение размеров РНК, лучшую аккомодацию и стандартизацию для различных экспериментальных дизайнов, а также четкое разграничение модификацийm6A в различных источниках РНК. В то время как известно, что модификации m6A оказывают решающее влияние на физиологию человека, связанную с циркадными ритмами и ожирением, их роль в других (пато)физиологических состояниях неясна. Таким образом, исследования модификацийm6A имеют огромные возможности для получения ключевых сведений о молекулярной физиологии.

Через 14 дней в нормальной свет-темнота циркадного фазы, мыши дикого типа, были помещены в постоянной темноте. РНК из печени отбирали каждые 4 ч и изучали с модифицированной северной блоттинга. Метилирование рРНК, мРНК, и малых РНК были четко обнаружены (рисунок 2). Сравнение между различными циркадных раза (КТ) могут быть точно вычислены со стандартом 18S рРНК. Был прочный циркадные колебания м 6 уровней А в рРНК, мРНК, и малых РНК. Для того, чтобы избежать помех протянутую рРНК, Полиаденилированная РНК могут быть очищены, как на этапе 1.2.2. После очистки рРНК может быть в значительной степени устранены , чтобы позволить для лучшей визуализации других РНК (рисунок 3). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> г&gt; Рисунок 1: Сборка блока переноса блот. Блок переноса капиллярная для блоттинга РНК к мембране показана. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Рисунок 2: Суточный ритм уровней м 6 А в C57BL / 6J. Эта цифра показывает 6 м пятном тотальной РНК из печени мышей дикого типа , забитых на первый день темно-темно - фазы через 14 дней нормального светло-темной фазы через 4 ч интервалами. Количественное было сделано с использованием м 6 разностное изображение плотности между 18S и 28S рРНК. М 6 А обилие нормализовалось к группе 18S рРНК из геля формальдегида в нижней части.и др = &quot;_blank&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Рисунок 3: 6 м A кляксы с или без рРНК. Представитель м 6 A - блоты полной РНК и РНК полиаденилированой из печени мышей дикого типа показаны. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10x МОПС буфер (рН 7,0, защищенном от света месте) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> МОПС </td><td> 41.85 </td><td> г </td><td> 0,2 М </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ацетат натрия </td><td> 4.1 </td><td> г </td><td>0,05 М </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> ЭДТА, динатриевой соли </td><td> 3.7 </td><td> г </td><td> 0,01 М </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC воды </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Всего </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Перемешивают при комнатной температуре </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x SSC буфер (рН 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> хлористый натрий </td><td> 175,3 </td><td> г </td><td> 3 М </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> тринатрийцитрат </td><td> 88,3 </td><td> г </td><td> 0,3 М </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC воды </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Всего </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Перемешивают при комнатной температуре, а затем автоклав </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Отслеживание Dye </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x МОПС буфер </td><td> 500 </td><td> мкл </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0,75 </td><td> г </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> бромфеноловый синий </td><td> 0,01 </td><td> г </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> ксиленцианол </td><td> 0,01 </td><td> г </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC воды </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Всего </td><td> 5 </td><td> мл </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Хранить при температуре -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> DEPC воды </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Развести соотношение 1: 1000 из DEPC в DDH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, а затем автоклав </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> Пример буфера (защиты от света) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x МОПС буфер </td><td> 200 </td><td> мкл </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% формальдегида </td><td> 270 </td><td> мкл </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> формамид </td><td> 660 </td><td> мкл </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Хранить при температуре -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tboду&gt; </table> Таблица 1: Буферы и растворы.

Модифицированный северный блоттинг метод измерения N 6 -methyladenosine (м 6 а) изменения в РНК описана. Текущий метод может обнаружить изменения в различных РНК и элементов управления в различных экспериментальных конструкций.

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Общая цель модифицированного метода нозерн-блоттинга заключается в измерении уровня N6-метиладенозина, модификаций n6A в РНК и обнаружении модификаций в различных типах РНК. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы о роли эпигенетики РНК, в частности, о модификациях N6-метиладенозина. Основным преимуществом данной методики является обеспечение эффективного разделения РНК, лучшая стандартизация планов экспериментов и четкое определение модификации n6A в РНК.Данный метод позволяет изучить модификации n6A в РНК и может быть применен к другим модификациям РНК с использованием соответствующих антител для детекции. Перед началом эксперимента распылите раствор для деконтаминации рибонуклеазы на бумажные полотенца и протрите ими дозаторы и поверхности лабораторного стола. Смочите бумажные полотенца водой, не содержащей нуклеаз, и повторно протрите дозаторы и поверхности лабораторного стола.Возьмите раствор для выделения РНК, выдержанный при температуре 4 °C, и добавьте 1 мл этого раствора примерно к 75 мг ткани мыши. Для гомогенизации ткани используйте верхний перемешиватель. Затем добавьте 100 мкл 1-бром-3-хлорпропана или BCP на каждый 1 мл гомогената образца.Интенсивно встряхивайте пробирки в течение 15 секунд, затем переходите к выделению общей РНК. С помощью спектрофотометра определите концентрацию РНК, измерив оптическую плотность при 260 нанометрах и 280 нанометрах. Проверьте качество образца РНК, проведя электрофорез в 0,8% агарозном геле.Промойте все оборудование для электрофореза диэтилпирокарбонатом или водой, обработанной DEPC. Поместите 2,5 грамма агарозы, а затем 215 миллилитров воды, обработанной DEPC, в колбу Эрленмейера и полностью расплавьте смесь в микроволновой печи. После расплавления раствора добавьте 12,5 миллилитров 10X MOPS-буфера.Добавьте в колбу 22,5 мл 37% формальдегида. Затем перелейте раствор в электрофоретическую камеру с гребенкой толщиной 1,5 мм. С помощью чистой гребенки сдвиньте пузырьки воздуха к краям геля.Дайте гелю затвердеть при комнатной температуре. Затем используйте предварительно приготовленный 1X MOPS-буфер для электрофореза, чтобы промыть лунки геля и провести предварительный запуск. Внесите образцы РНК в лунки геля, после чего запустите электрофорез.На следующий день исследуйте гель и сфотографируйте его под УФ-светом. Для подготовки к переносу разрежьте гель и удалите неиспользуемую часть. Приготовьте 500 миллилитров 10X салиново-цитратного буфера (SSC).Промойте гель дважды буфером 10X SSC. Вырежьте один лист фильтровальной бумаги, размер которого достаточно велик, чтобы полностью закрыть гель. Вырежьте четыре фрагмента фильтровальной бумаги точно такого же размера, как и гель.Затем вырежьте лист положительно заряженной нейлоновой мембраны того же размера, что и гель. Сделайте зазубрину на геле и мембране в качестве метки для обеспечения правильной ориентации. Замочите мембрану в 2X SSC буфере.Налейте 500 миллилитров 10X SSC буфера в лоток для переноса. Положите большой лист фильтровальной бумаги на стеклянную пластину и смочите фильтровальную бумагу буфером для переноса. Затем с помощью пипетки удалите все пузырьки воздуха.Замочите два предварительно вырезанных кусочка фильтровальной бумаги в трансферном буфере и поместите их в центр фильтровальной бумаги. Удалите все пузырьки воздуха. Затем положите гель верхней стороной вниз на фильтровальную бумагу, а сверху на гель положите мембрану, убедившись, что выемки геля и мембраны совмещены.Затем поместите два предварительно вырезанных кусочка фильтровальной бумаги поверх мембраны. Удалите все пузырьки воздуха между слоями. Оберните гель пластиковой пленкой, чтобы салфетки впитывали только буфер, проходящий через гель и мембрану.Затем на фильтровальную бумагу уложите бумажные полотенца. Сверху на полотенца положите стеклянную пластину большего размера, на нее установите груз и оставьте РНК для переноса из геля на мембрану на ночь. После переноса храните мембрану во влажном состоянии в 2X SSC буфере.Смочите два листа фильтровальной бумаги в 10X SSC буфере, затем поместите их в УФ-кросслинкер. Убедитесь, что сторона, поглотившая РНК, обращена вверх, после чего наложите мембрану на фильтровальную бумагу. Выберите режим автоматического кросслинкинга и нажмите кнопку пуска, чтобы начать облучение.Осмотрите мембрану и гель с помощью системы визуализации УФ-гелей, чтобы подтвердить перенос РНК с геля на мембрану. Заблокируйте мембрану в 5% растворе обезжиренного молока в буфере TBST при комнатной температуре в течение одного часа. Инкубируйте мембрану в растворе антител к m6A в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.На следующий день промойте мембрану трижды буфером TBST по 15 минут. Затем инкубируйте мембрану в растворе антител кролика к кролику, конъюгированных с HRP, в течение одного часа при комнатной температуре. По истечении одного часа промойте мембрану трижды буфером TBST по 15 минут.Нанесите улучшенный субстрат для химилюминесценции. Зафиксируйте сигнал химилюминесценции с помощью цифрового имиджера. В завершение перейдите к количественному определению m6A и измерьте относительную интенсивность химилюминесценции m6A с помощью Image J. Образцы РНК печени мыши отбирали с четырехчасовым интервалом и исследовали с помощью модифицированного метода северного блоттинга.Было четко зафиксировано метилирование рРНК, мРНК и малых РНК. Репрезентативный анализ m6A-блоттинга был проведен для общей РНК и РНК без рРНК из печени мышей дикого типа. После освоения данной методики ее выполнение занимает четыре дня при условии правильного соблюдения протокола.После своей разработки эта методика открыла исследователям в области эпигенетики РНК возможность изучать влияние на физиологию человека, связанное с циркадными ритмами и ожирением.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Здесь мы описываем протокол для биохимических характеристик РНК изменение фермента дрожжей, Mod5 и обсудить, как этот протокол может применяться для других РНК модификация ферментов.

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

Здесь мы представляем протокол для DNAzyme-зависимого расщепления РНК. Это позволяет быстро и на основе места анализа РНК 2'-O-метилирования. Этот подход может быть использован для предварительной или крупной оценки активности сноРНА.

Днк-зависимый анализ rRNA 2'-O-Метилирования

Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.

Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы

Анализ иммунопреципиентации метилированной РНК является методом на основе антител, используемым для обогащения метилированных фрагментов РНК. В сочетании с глубоким секвенированием, это приводит к идентификации стенограмм с модификациейm 5C.

Метилированная РНК Иммунопреципиентация Анализ для изучения m5C Модификация в Arabidopsis

Здесь описан точный и воспроизводимый метод количественного определения in vivo нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Этот метод использует ВЭЖХ-МС/МС.

Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS

Настоящий протокол описывает получение и количественное измерение свободного и связанного с белком аргинина и метил-аргининов с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии.

Исследование метилома аргинина с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса

Посттранскрипционные модификации РНК представляют собой недостаточно изученный слой регуляции трансляции, который недавно был связан с пластичностью центральной нервной системы. Здесь описан подход пробоподготовки и жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии для одновременной характеристики многочисленных модификаций РНК в отдельных нейронах.

Характеристика модификаций РНК в одиночных нейронах с помощью масс-спектрометрии

Протокол содержит инструкцию по модификации РНК диметилсульфатом для экспериментов по мутационному профилированию. Он включает в себя зондирование in vitro и in vivo с двумя альтернативными методами подготовки библиотеки.

Зондирование структуры РНК с мутационным профилированием диметилсульфата с секвенированием in vitro и в клетках

Здесь мы представляем протокол для полуколичественной оценки глобальных уровней m⁶A с помощью точечного блота. Общая РНК извлекается, денатурируется, выявляется на нейлоновой мембране, пробуется антителом против m⁶A и визуализируется с помощью хемилюминесценции. Интенсивность сигнала, количественно измеряемая с помощью серого анализа ImageJ, отражает относительное количество метилирования, обеспечивая воспроизводимый рабочий процесс для исследований.

Анализ с точками для обнаружения глобальных уровней модификации РНК N6-метиладенозина

Этот протокол предоставляет подробный подход к оценке уровней модификации m6A специфической РНК с помощью MeRIP-qPCR.

MeRIP-qPCR анализ для обнаружения уровней модификацииm6A специфических РНК в клетках остеосаркомы

Изучите модифицированный метод северного блоттинга для измерения модификаций N6-метиладенозина в РНК образцов мышиных тканей. Этот подход позволяет эффективно выявлять эпигенетические изменения в рРНК, мРНК и малых РНК.

Метод для измерения РНК

Больше видео