November 11th, 2016
Здесь мы описываем настройки для параллельного мониторинга циркадной биолюминесценции и секреторной активности островковых клеток человека и первичных миотрубок. Для этого мы использовали лентивирусную доставку гена репортера ядра люциферазы с последующей синхронизацией in vitro и сбором исходящей среды путем непрерывного перифузии клеток.
Общей целью данной процедуры является параллельная оценка циркадной биолюминесценции и секреторной активности первичных эндокринных клеток человека, культивируемых и синхронизированных in vitro. Этот метод может помочь исследовать временную закономерность клеточной секреции и то, как она может регулироваться клеточными автономными циркадными часами. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет контролировать циркадные люциферины как репортерную активность и, одновременно собирать отток среды для измерения уровня секретируемых гормонов и миокинов. Чтобы ввести циркадные биолюминесцентные репортеры в первичные клетки с помощью лентивирусной трансдукции, сначала перенесите чашки Петри размером 3,5 см, содержащие человеческие миобласты с конфлюенцией от 30% до 50%, в шкаф с ламинарным потоком. Замените среду миобласта человека 2 мл питательной среды. Затем трансдуцируют первичную клеточную культуру путем пипетирования раствора лентивируса в чашку для получения кратности инфекции, равной трем. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур. Смените носитель на следующий день. Для достижения синхронизации in vitro добавляют 10 микромолярного активатора аденилатциклазы в 2 мл среды на чашку Петри размером 3,5 см, содержащую ранее трансфицированные первичные клетки. Инкубируйте клетки в течение 60 минут при 37
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
В этом исследовании описываются методы мониторинга циркадной биолюминесценции наряду с секреторной активностью клеток островков поджелудочной железы человека и первичных миотуб. Методика включает доставку генетического материала лентивирусом с целью выражения репортера ядра циклов и последующую синхронизацию in vitro и непрерывную перифузию клеток для сбора среды.
Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures enables direct interrogation of temporal regulation in human endocrine and muscle systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by linking molecular circadian oscillators to functional secretory outputs. Integrating these measurements at the discovery stage supports risk-adjusted advancement of metabolic and chronobiology programs across the portfolio.
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of circadian regulation in human primary cells, supporting both target validation and translational continuity.