Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур
11 ноября 2016 г.
Здесь мы описываем настройки для параллельного мониторинга циркадной биолюминесценции и секреторной активности островковых клеток человека и первичных миотрубок. Для этого мы использовали лентивирусную доставку гена репортера ядра люциферазы с последующей синхронизацией in vitro и сбором исходящей среды путем непрерывного перифузии клеток.
Общей целью данной процедуры является параллельная оценка циркадной биолюминесценции и секреторной активности первичных эндокринных клеток человека, культивируемых и синхронизированных in vitro. Этот метод может помочь исследовать временную закономерность клеточной секреции и то, как она может регулироваться клеточными автономными циркадными часами. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет контролировать циркадные люциферины как репортерную активность и, одновременно собирать отток среды для измерения уровня секретируемых гормонов и миокинов. Чтобы ввести циркадные биолюминесцентные репортеры в первичные клетки с помощью лентивирусной трансдукции, сначала перенесите чашки Петри размером 3,5 см, содержащие человеческие миобласты с конфлюенцией от 30% до 50%, в шкаф с ламинарным потоком. Замените среду миобласта человека 2 мл питательной среды. Затем трансдуцируют первичную клеточную культуру путем пипетирования раствора лентивируса в чашку для получения кратности инфекции, равной трем. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур. Смените носитель на следующий день. Для достижения синхронизации in vitro добавляют 10 микромолярного активатора аденилатциклазы в 2 мл среды на чашку Петри размером 3,5 см, содержащую ранее трансфицированные первичные клетки. Инкубируйте клетки в течение 60 минут при 37
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании описаны методы мониторинга циркадной биолюминесценции параллельно с секреторной активностью клеток островков человека и первичных миотрубок. Подход включает лентивирусную доставку гена репортера основных циркадных часов люциферазы с последующей синхронизацией in vitro и непрерывной перифузией клеток для сбора среды.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Хронобиология
Введение
- Циркадные ритмы играют важнейшую роль в клеточных функциях.
- Мониторинг биолюминесценции позволяет получить данные о клеточной активности.
- Клетки островков человека жизненно важны для секреции инсулина.
- Первичные миотрубки имеют важное значение для изучения физиологии мышц.
Цель исследования
- Исследовать взаимосвязь между циркадными ритмами и секреторной активностью.
- Разработать метод мониторинга клеточных функций в режиме реального времени.
- Углубить понимание метаболических процессов в клетках человека.
Используемые методы
- Лентивирусная доставка генов для экспрессии репортерной люциферазы.
- Синхронизация клеточных культур in vitro.
- Непрерывная перифузия для сбора среды.
- Измерение биолюминесценции для оценки циркадных ритмов.
Основные результаты
- Успешный мониторинг циркадной биолюминесценции в клетках островков человека.
- Продемонстрированная секреторная активность первичных миотрубок.
- Разработан надежный метод изучения клеточных ритмов.
- Получены данные о взаимосвязи между циркадной биологией и клеточной функцией.
Заключение
- Исследование предлагает новый подход для мониторинга клеточных процессов в режиме реального времени.
- Полученные результаты способствуют пониманию влияния циркадных ритмов на метаболизм.
- Потенциальные области применения в исследованиях диабета и физиологии мышц.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Параллельное измерение экспрессии генов циркадных часов и секреции гормонов в первичных культурах клеток человека позволяет напрямую изучать временную регуляцию в эндокринной и мышечной системах человека. Такой подход повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, связывая молекулярные циркадные осцилляторы с функциональными секреторными результатами. Интеграция этих измерений на этапе поиска способствует обоснованному продвижению программ в области метаболизма и хронобиологии по всему портфелю с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Позволяет снизить механистические риски путем установления корреляции между активностью генов циркадных ритмов и секрецией гормонов и миокинов в первичных клетках человека.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем нарушения работы основных генов циркадных ритмов и количественного определения последующих секреторных эффектов.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе сигнальных путей для метаболических и эндокринных мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создавать валидированные синхронизированные системы первичных клеток для надежной разработки анализов.
- Обеспечивает количественные временные показатели как экспрессии генов, так и секреторной активности.
- Обеспечивает воспроизводимую оценку влияния соединений или генетических воздействий на циркадно-регулируемые показатели.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с физиологией человека при соответствующих заболеваниях, используя первичные клетки островков и мышечные клетки.
- Способствует поиску трансляционных биомаркеров, связывая нарушение работы молекулярных часов с функциональными фенотипами секреции.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации в исследованиях метаболизма и хронобиологии.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Этот метод связывает этап предварительных открытий и доклинические исследования, позволяя проверять гипотезы о циркадной регуляции в первичных клетках человека, что способствует как валидации мишеней, так и обеспечению трансляционной преемственности.
- Открытия в биологии: позволяет напрямую проверять функцию циркадных генов и их влияние на секреторные пути.
- Скрининг: предоставляет синхронизированные, готовые к анализу модели первичных клеток с количественными показателями для оценки соединений.
- Аналитика: генерирует данные о биолюминесценции и секреции с временным разрешением для надежного статистического сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает нарушения работы молекулярных часов с соответствующими заболеванию секреторными фенотипами в клетках человека.
- Корпоративное повторное использование: предлагает многократно используемую платформу для оценки циркадной регуляции в различных типах первичных клеток и мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы долгосрочных параллельных измерений в первичных клетках человека.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет установления связи между молекулярными и функциональными результатами в системах, релевантных для заболевания.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию программ по метаболизму и хронобиологии с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с лентивирусной трансдукцией, культурами первичных клеток и измерением биолюминесценции.
- Необходим доступ к синхронизированным системам перфузии и чувствительным методам анализа гормонов/миокинов.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости данных при сборе временных рядов.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов первичных клеток или других секреторных конечных точек.
- Для каждого конкретного применения необходимо подтвердить стабильность репортера и возможность длительного культивирования.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
