Loop Arteriovenous (AV) в модели мелких животных для изучения ангиогенеза и васкуляризированных тканевой инженерии
2 ноября 2016 г.
Мы описываем микрохирургической подход к генерации артериовенозные (AV) петли в качестве модели для анализа васкуляризации в естественных условиях в изолированном и хорошо охарактеризованного окружающей среды. Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но и оптимально подходит для инженерных и аксиально васкуляризированных перевивных тканей.
Общая цель данного микрохирургического подхода заключается в создании артериовенозной петли для инженерии аксиолизированных, васкуляризированных и трансплантируемых тканей, а также для анализа васкуляризации in vivo, а также в изолированной и хорошо охарактеризованной среде. С помощью этого метода мы можем использовать собственные организмы в качестве живых биореакторов для создания различных типов аксиолизированных васкуляризированных тканей, адаптированных к индивидуальным потребностям пациента. Основным преимуществом данной техники является то, что созданная ткань может быть пересажена вместе с ее сосудистым доступом и соединена с местными сосудами на стороне реципиента для немедленного снабжения кислородом и питательными веществами.
Помимо исследований в области тканевой инженерии, данный метод позволяет изучить процессы ангиостеноза в живом организме. Он также может быть применен при патологических состояниях, таких как ангиогенез при раке. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за высокой сложности хирургического вмешательства, в частности, при выполнении микроанастомоза субмиллиметрового сосуда.
Идея этого метода возникла у нас при работе с клиническими случаями обширных дефектов тканей, которые требовали трансплантации аутологичной васкуляризированной ткани, что создавало значительную подвижность в области донорского участка. После подтверждения надлежащей анестезии взвесьте крысу для расчета доз препаратов. Затем нанесите глазную мазь для предотвращения пересыхания слизистой во время анестезии.
После введения обезболивающих препаратов и антибиотиков поместите крысу на грелку и начните подачу изофлурана в непрерывном режиме. Затем повторно проверьте глубину анестезии с помощью щипкового теста (сжатия пальца лапы). По возможности используйте пульсоксиметрию для контроля уровня анестезии крысы.
Продолжите, выбрів шерсть на внутренней стороне задних конечностей. Затем продезинфицируйте операционное поле, поочередно используя бетадин и спиртовой раствор. После этого разведите задние конечности и зафиксируйте их с помощью адгезивной ленты.
Наконец, поместите крысу под хирургический микроскоп и застелите стерильным операционным бельем. Проведите операцию, соблюдая правила стерильности. С помощью скальпеля сделайте продольный разрез кожи в средней части левого бедра от верхней части колена до паха.
Затем, используя диссекционные ножницы и микропинцет, послойно рассеките подкожную клетчатку и фасцию на протяжении примерно трех сантиметров. Прекратите разрез, когда бедренный сосудисто-нервный пучок будет обнажен от тазовой артерии в паху до колена. После этого, используя ножницы для жировой ткани и микропинцет, отделите сосуды и удалите жировую ткань.
При необходимости коагулируйте боковые ветви с помощью электрокоагуляции. По завершении накройте операционное поле влажным компрессом и повторите процедуру на правой стороне крысы. После того как первая процедура будет симметрично выполнена на обеих сторонах, приступите к забору венозного трансплантата.
Сначала перевяжите правую бедренную вену с помощью электрокоагуляции на проксимальном и дистальном концах, чтобы получить трансплантат длиной примерно от 1 до 1.5 см. Затем извлеките венозный трансплантат с помощью микропинцета. Для расширения отверстия венозного трансплантата используйте расширитель сосудов.
Затем промойте венозный трансплантат раствором гепарина с помощью ирригационной канюли. Перенесите промытый трансплантат на левое бедро и накройте операционное поле с правой стороны влажным компрессом. Далее проксимально перевяжите бедренную вену слева в паховой области с помощью микрососудистого зажима.
Затем коагулируйте бедренную вену дистально в верхней части колена перед местом разветвления. Для выполнения анастомоза соедините проксимальный конец венозного трансплантата с проксимальным концом вены, используя технику «конец в конец» и шов 11-0. Начните с наложения первых двух швов в положениях на 12 и 6 часов.
Затем наложите еще от двух до трех швов между этими точками на передней стороне. После этого наложите от двух до трех швов на задней стороне. Анастомоз петель сосудов является наиболее критическим этапом протокола.
Важно обеспечить максимальную точность наложения швов, чтобы снизить риск пережатия и закрытия сосудов петли. Затем перевяжите бедренную артерию с помощью микрососудистого зажима и выполните электрокоагуляцию аналогично перевязке бедренной вены. Перед продолжением убедитесь, что сосуды петли не перекручены.
Затем выполните анастомоз дистального конца венозного трансплантатa с проксимальным концом артерии, используя ту же технику наложения швов, что была продемонстрирована ранее. После второго анастомоза введите 25 iu гепарина внутривенно. Теперь повторно убедитесь, что сосуды петли не перекручены, и снимите зажимы.
Наблюдайте за петлей в течение примерно пяти минут, проверяя ее на наличие утечек и проходимость. При наличии проходимости петля расширится, и будет видна пульсация артерии. Во время наблюдения капайте папаверин на сосуды для предотвращения сосудистых спазмов.
Затем предварительно заполните имплантационную камеру первой половиной матричной смеси, примерно 0,5 мл. После этого поместите петлю в имплантационную камеру. Закройте вход в камеру двумя сгустками фибрина и заполните камеру второй половиной матричной смеси, чтобы общий объем составил 1 мл.
Теперь закрепите камеру на бедре, закройте ее крышкой и зафиксируйте крышку нерассасывающимся швом 6-0. Затем закрепите имплантационную камеру на бедре дополнительным нерассасывающимся швом 6-0. Остановите любое кровотечение с помощью электрокоагуляции.
Наконец, зашейте кожу рассасывающимися швами 4-0 и покройте рану алюминиевым спреем. Для целей костной тканевой инженерии в модель А-V петли на крысах было имплантировано несколько различных костных заменителей. Васкуляризация наблюдалась с помощью 3D микрокомпьютерной томографии.
Предварительная васкуляризация обработанного губчатого костного матрикса быка в течение шести недель привела к более высокой выживаемости введенных остеобластов. Петли собирали, разрезали и окрашивали в различные временные точки после имплантации. Например, окрашивание гематоксилином и эозином показало, что использование костного заменителя на основе бета-трикальцийфосфата и гидроксиапатита с мезенхимальными стволовыми клетками привело к образованию множества сосудистых соединений в течение шести недель.
После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает от пяти до шести часов. Следуя этой процедуре, можно имплантировать большое разнообразие различных клеточных факторов или антител для изучения широкого спектра состояний. Данный метод также применим в модели венозной петли на крупных животных (овцах).
Таким образом, это позволит исследователям создавать васкуляризированные ткани в больших, клинически значимых объемах. Данная модель может предоставить возможность изучать васкуляризацию при патологических состояниях. Например, можно будет исследовать влияние различных факторов роста и клеток на формирование сосудистой сети опухоли
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается микрохирургический подход к созданию артериовенозной (АВ) петли, которая служит моделью для анализа васкуляризации in vivo. Эта методика полезна для исследования ангиогенеза и создания пересаживаемых тканей с аксиальной васкуляризацией.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Тканевая инженерия
- Биология сосудов
Теоретическая часть
- Модель артериовенозной (АВ) петли позволяет изучать васкуляризацию в контролируемой среде.
- Этот метод позволяет использовать организм пациента в качестве биореактора для генерации тканей.
- Он обеспечивает немедленный сосудистый доступ для подачи кислорода и питательных веществ.
- С помощью этого метода можно получить представление об ангиогенезе и патологических состояниях, таких как рак.
Цель исследования
- Разработать метод создания васкуляризированных тканей.
- Проанализировать процессы васкуляризации в живых организмах.
- Изучить особенности ангиогенеза при нормальном состоянии и патологиях.
Используемые методы
- Микрохирургические методы создания артериовенозных (AV) петель.
- Микроанастомоз субмиллиметровых сосудов.
- Анализ васкуляризации in vivo.
- Применение модели для изучения ангиогенеза при раке.
Основные результаты
- Петля АВ успешно поддерживает васкуляризированную тканевую инженерию.
- Немедленное соединение с местными сосудами улучшает снабжение питательными веществами.
- Получены данные о процессах ангиостеноза.
- Метод продемонстрировал потенциал для персонализированной тканевой инженерии.
Выводы
- Данный микрохирургический подход является ценным инструментом для сосудистых исследований.
- Он облегчает создание трансплантируемых тканей, адаптированных к индивидуальным потребностям.
- Дальнейшие исследования могут расширить возможности его применения при патологических состояниях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Модель артериовенозной (АВ) петли создает контролируемую среду in vivo для изучения ангиогенеза и формирования васкуляризированных тканей, что отвечает критической потребности доклинических исследований в воспроизводимых моделях васкуляризации. Позволяя изолировать сосудистые процессы от системных влияний, данная модель способствует механистическому снижению рисков при оценке проангиогенных и антиангиогенных кандидатов. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и идентификации ведущих соединений для разработки средств терапии сосудистых заболеваний и применения в регенеративной медицине.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с ангиогенными и антиангиогенными путями в системе, релевантной конкретному заболеванию.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную модель для функциональной валидации мишеней посредством прямой визуализации формирования сосудистой сети.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем получения количественных данных о васкуляризации для снижения рисков, связанных с неопределенностью механизмов действия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных васкуляризированных биологических систем для последующего скрининга соединений и анализа биомаркеров.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет изолированной микросреды и контролируемой камеры имплантации.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы в различных экспериментальных условиях путем изменения матриксов, типов клеток и факторов роста.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Обеспечивает возможность создания васкуляризированных тканей, которые можно эксплантировать и соединить микрохирургическим путем с сосудами реципиента для немедленной перфузии.
- Доклиническая модель: Позволяет оценивать тканеинженерные конструкции в системе, релевантной заболеванию, перед проведением исследований на крупных животных.
- Прогресс с учетом рисков: Помогает принимать решения о целесообразности дальнейшего продолжения исследований (go/no-go) путем оценки сосудистой интеграции и выживаемости имплантированных клеток или тканей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель AV-петли вписывается в континуум исследований — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, что особенно актуально для программ по биологии сосудов и тканевой инженерии.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая визуализацию ангиогенеза в режиме реальногого времени с помощью 3D-визуализации и иммуногистологии.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных за счет измерения плотности сосудов и перфузии в изолированной петлевой камере.
- Аналитика: предоставляет статистические данные сосудистой морфометрии и показателей перфузии, что позволяет проводить сравнительный анализ различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет создания трансплантируемых преваскуляризированных тканей с немедленным сосудистым доступом.
- Повторное использование в масштабах предприятия: служит универсальной платформой для изучения различных ангиогенных модуляторов и типов тканей в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности сосудистых ответов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря микрохирургической точности и контролируемой среде в камере.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снижать риски, связанные с сосудистыми мишенями, и сокращать количество неудач на поздних стадиях программ по тканевой инженерии.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию сосудистых терапевтических средств и регенеративных кандидатов с учетом рисков на основе подтвержденного потенциала васкуляризации.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургических методов, в частности, в микроанастомозе субмиллиметровых сосудов.
- Зависимость от специализированного инструментария, включая хирургические микроскопы, сосудистые дилататоры и инструменты для коагуляции.
- Необходима межкомандная стандартизация хирургических протоколов и послеоперационный мониторинг проходимости петель.
- Требуется учет особенностей адаптации при применении модели к различным типам тканей, источникам клеток или составам матрикса.
- Ограничено сложностью хирургического вмешательства и периодом обучения, что может повлиять на пропускную способность и воспроизводимость результатов разными операторами.
