Характеристика Multi-субъединица белковых комплексов человеческого MxA Использование неденатурирующем электрофорез на полиакриламидном геле

Общая цель данного эксперимента — определить количество субъединиц в гомоолигомерных белковых комплексах в клеточных лизатах с помощью неденатрирующего электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, такие как определение олигомерного статуса белков, участвующих в фундаментальных клеточных процессах. Основным преимуществом данной методики является то, что она не требует очистки гомоолигомерных белковых комплексов или использования специализированного дорогостоящего оборудования.

Следовательно, данный метод может быть реализован в большинстве лабораторий. В этом эксперименте используются два типа клеток: клетки A549, экспрессирующие эндогенный белок устойчивости к миксовирусам A (MxA), и вироклетки с гиперэкспрессией MxA.

Высейте клетки A549 и вироклетки в шестилуночные планшеты, добавив по два миллилитра ростовой среды в каждую лунку. Инкубируйте клетки в инкубаторе для культур клеток в течение ночи. На следующий день соберите клетки.

Промойте каждую лунку одним миллилитром PBS и отсоедините клетки, добавив 0,5 миллилитра 0,25% раствора Trypsin-EDTA примерно на пять минут при комнатной температуре. Как только клетки открепятся от поверхности лунки, добавьте 0,5 миллилитра ростовой среды и осторожно перемешайте, всасывая и вытесняя жидкость пипеткой. Перенесите клетки из каждой лунки в пробирку объемом два миллилитра и осадите их с помощью настольной центрифуги.

Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки, не затрагивая осадок клеток. Промойте клетки, добавив 1 мл ледяного PBS, и аккуратно перемешайте клеточную суспензию, перемещая ее пипеткой вверх и вниз. Осадите клетки в настольной центрифуге.

Осторожно удалите супернатант с помощью пипетирования, не затрагивая осадок клеток. Добавьте 200 µL ледяного лизирующего буфера, ресуспендируйте клетки путем перемешивания пипеткой и поместите на лед. Немедленно защитите лизат от света, обернув пробирки алюминиевой фольгой, так как иодацетамид в лизирующем буфере чувствителен к свету.

Инкубируйте на льду в течение 30 минут. Использование иодацетамида имеет решающее значение, поскольку иодацетамид необратимо защищает тиольную группу свободных цистеинов путем образования тиоэфирной связи и предотвращает искусственную агрегацию белков. Затем удалите клеточный дебрис путем центрифугирования в предварительно охлажденной настольной центрифуге.

Во время центрифугирования подготовьте диализные колонки с пределом отсечения по молекулярной массе 10 000. Прикрепите диализные колонки к поплавку и поместите их в стакан с предварительно охлажденным диализным буфером для уравновешивания колонок. Не касайтесь мембраны.

Поместите магнитный перемешиватель в стакан и перенесите стакан в холодильную камеру. Используя магнитный перемешиватель для обеспечения осторожного перемешивания, выдержите пробу в течение 20 минут при температуре 4 °C. Через 20 минут извлеките колонки из диализного буфера и поплавка.

Перенесите очищенные лизаты в подготовленные диализные колонки, используя дозатор, не касаясь мембраны. Закрепите колонки на поплавке. Поместите их обратно в стакан с диализным буфером, после чего перенесите стакан в помещение с контролируемой низкой температурой.

Диализуйте лизат в течение как минимум четырех часов при температуре четыре градуса Цельсия, осторожно перемешивая магнитным перемешивателем для удаления низкомолекулярных метаболитов и солей, которые могут помешать проведению недентурирующего полиакриламидного гель-электрофореза. По завершении диализа перенесите каждый диализованный образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Удалите осадок путем центрифугирования в настольной центрифуге.

Электрофорез необходимо проводить сразу после диализа лизатов, чтобы предотвратить диссоциацию олигомерных белковых комплексов. Заполните внутреннюю и внешнюю камеры геля предварительно охлажденным рабочим буфером. Проведите предварительный запуск недентурирующего полиакриламидного геля с предварительно охлажденным рабочим буфером при силе тока 25 мА на гель в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Смешайте 15 µL подготовленного лизата с пятью µL 4X буфера для образцов. Нанесите на гель выбранный стандарт нативного белка и 15 µL образца. Проведите электрофорез при 25 mA в течение четырех часов при температуре четыре °C.

По завершении недентурирующего электрофореза в полиакриламидном геле извлеките гель и осторожно перенесите его в буфер с SDS. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Для каждого геля подготовьте две губки, четыре листа целлюлозной фильтровальной бумаги и блоттинговую мембрану, затем замочите их в блоттинговом буфере.

Соберите «сэндвич» в следующем порядке, снизу вверх: одна губка, два листа целлюлозного фильтровального материала, блоттинговая мембрана, гель, два листа целлюлозного фильтровального материала и одна губка. Поместите «сэндвич» в камеру для блоттинга, убедившись, что мембрана обращена к положительному полюсу, а гель — к отрицательному.

Заполните камеру для вестерн-блоттинга предварительно охлажденным буфером для переноса. Для достижения наилучших результатов переноса белка проводите блоттинг при силе тока 90 мА в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день разберите «сэндвич».

Инкубируйте мембрану в растворе Ponceau S в течение пяти минут при комнатной температуре для визуализации стандарта белков. Удалите краситель с мембраны, поместив ее в деионизированную воду и промыв. После переноса мембраны в лоток отметьте полосы стандарта белков с помощью маркера.

Заблокируйте мембрану блокирующим буфером в течение не менее одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем визуализируйте целевые белки с помощью иммуноокрашивания, используя кроличьи поликлональные антитела к MxA, как описано в текстовом протоколе. Вироклетки, лишенные эндогенного MxA, были трансфецированы рекомбинантным MxA дикого типа, а также мономерным и димерным вариантами MxA.

Миграция вариантов рекомбинантного MxA с ожидаемой молекулярной массой подтвердила их олигомерное состояние. Эктопически экспрессированный MxA дикого типа мигрировал в виде тетрамера. Эти рекомбинантные белки затем были использованы для оценки олигомерного состояния эндогенного белка MxA человека, полученного из клеток A549, стимулированных интерфероном-альфа.

Результаты показали, что размер MxA в лизатах клеток A549, стимулированных интерфероном-альфа, соответствует тетрамеру. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает полтора дня. При выполнении этой процедуры важно помнить, что образцы нельзя замораживать и размораживать на протяжении всего процесса, так как это может привести к разрушению белковых взаимодействий или вызвать агрегацию белков.

Кроме того, при работе со светочувствительными реагентами, такими как иодоацетамид, важно защищать образцы от света на этапе лизиса. После проведения недентурирующего SDS-PAGE можно применить другие методы, такие как экстракция белков из геля, анализ ферментативной активности AsiS или двухмерный электрофорез (PAGE), чтобы получить ответы на дополнительные вопросы, касающиеся ферментативной активности и характеристики потенциальных гетеро-олигомерных комплексов. После разработки этот метод открыл перед исследователями в области клеточной биологии возможности по изучению состава олигомерных белковых комплексов в культивируемых клетках.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготавливать клеточные лизаты из клеточных культур для изучения олигомерных белков с помощью неденурирующего электрофореза в ПАГ. Не забудьте, что работа с иодацетамидом может быть крайне опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и средств защиты глаз.