Характеристика Multi-субъединица белковых комплексов человеческого MxA Использование неденатурирующем электрофорез на полиакриламидном геле

Общей целью данного эксперимента является определение количества субъединиц в гомоолигомерных белковых комплексах в клеточных лизатах с помощью электрофореза в неденатурирующем геле додекосульфата натрия и полиакриламида. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, такие как олигомерный статус белков, участвующих в фундаментальных клеточных процессах. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она не требует очистки гомоолигомерных белковых комплексов или специализированного, дорогостоящего оборудования.

Поэтому его можно проводить в большинстве лабораторий. В этом эксперименте используются два типа клеток. Клетки А549, экспрессирующие эндогенный белок устойчивости к миксовирусу А, или MxA; и вироклетки, которые сверхэкспрессируют MxA.

Посейте клетки А549 и вироклетки в шесть лунок с двумя миллилитрами питательной среды на лунку. Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур. На следующий день соберите клетки.

Промойте каждую лунку одним миллилитром PBS и присоедините ячейки, добавив 0,5 миллилитра 0,25% раствора трипсина-ЭДТА примерно на пять минут при комнатной температуре. Как только клетки отделятся от чашки, добавьте 0,5 миллилитра питательной среды, и тщательно перемешайте пипеткой вверх и вниз. Переложите ячейки каждой лунки в двухмиллилитровую пробирку и гранулируйте их с помощью настольной центрифуги.

Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, не нарушая клеточную гранулу. Промойте клетки, добавив один миллилитр ледяного PBS и тщательно пипетируя клеточную суспензию вверх и вниз. Гранулируйте ячейки в настольной центрифуге.

Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, не отрывая клеточную гранулу. Добавьте 200 микролитров ледяного буфера для лизиса, повторно суспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз, а затем положите на лед. Немедленно защитите лизат от света, накрыв трубки фольгой, потому что йодоацетамид в буфере для лизиса светочувствительный.

Выдерживать на льду в течение 30 минут. Использование йодоацетамида имеет решающее значение, поскольку йодоацетамид необратимо защищает тиоловую группу свободных цистеинов, образуя тиоэфирную связь, и предотвращает искусственную агрегацию белков. Затем удалите клеточный мусор путем центрифугирования в предварительно охлажденной настольной центрифуге.

Во время центрифугирования готовят диализные колонки с отсечкой по молекулярной массе 10 000. Прикрепите диализные колонны к поплавковому бую и поместите их в стакан, заполненный предварительно охлажденным диализным буфером, чтобы уравновесить колонны. Не прикасайтесь к мембране.

Поместите магнитную мешалку в стакан и перенесите стакан в холодильную камеру. Используя магнитную мешалку для обеспечения осторожного перемешивания, уравновесьте в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Через 20 минут снимите столбики с диализного буфера и поплавкового буя.

Очищенные лизаты переложить в подготовленные диализные колонки методом пипетирования, не касаясь мембраны. Прикрепите колонны к поплавковому бую. Положите их обратно в стакан, наполненный диализным буфером, а затем перенесите стакан в холодильную камеру.

Диализируйте лизат в течение не менее четырех часов при четырех градусах Цельсия, осторожно помешивая магнитной мешалкой, чтобы удалить мелкие метаболиты и соли, которые могут помешать неденатурирующему гелевому электрофорезу полиакриламида. Когда диализ будет завершен, переложите каждый диализованный образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Удалите осадки центрифугированием в настольной центрифуге.

Электрофорез необходимо проводить сразу после диализа лизатов для предотвращения диссоциации олигомерных белковых комплексов. Заполните внутреннюю и внешнюю гелевую камеры предварительно охлажденным рабочим буфером. Предварительно запустите неденатурирующий полиакриламидный гель с предварительно охлажденным рабочим буфером со скоростью 25 миллиампер на гель в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Смешайте 15 микролитров приготовленного лизата с пятью микролитрами буфера для образца 4X. Загрузите в гель выбранный стандарт нативного белка и 15 микролитров образца. Запустите гель при температуре 25 миллиампер в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия.

Когда электрофорез неденатурирующего полиакриламидного геля будет завершен, разберите гель и осторожно перенесите его в буфер SDS. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием. Подготовьте две губки, четыре листа целлюлозной фильтровальной бумаги и промокательную пленку на гель и замочите их в промокательном буфере.

Собираем бутерброд следующим образом снизу вверх. Одна губка, два листа целлюлозной фильтровальной бумаги, промокательная пленка, гель, два листа целлюлозной фильтровальной бумаги и одна губка. Поместите бутерброд в промокательную емкость, убедившись, что мембрана обращена к плюсовому полюсу, а гель — к минусовому.

Заполните промокательную емкость предварительно охлажденным промокательным буфером. Для достижения наилучших результатов переноса белка промокните при температуре 90 миллиампер на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день разберите бутерброд.

Инкубируйте мембрану в растворе Ponceau S в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы визуализировать стандарт белка. Удалите пятна с мембраны, поместив ее в деионизированную воду и промыв ее. После переноса мембраны в лоток отметьте полосы стандарта белка с помощью ручки.

Заблокируйте мембрану блокирующим буфером не менее чем на один час при комнатной температуре или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Впоследствии представляющие интерес белки визуализируют путем иммуноокрашивания с использованием поликлонального антитела кролика, направленного против MxA, как описано в текстовом протоколе. Вироклетки, лишенные эндогенного MxA, трансфицировали рекомбинантным диким типом MxA и мономерной и димерной вариацией MxA.

Миграция рекомбинантной вариации MxA при их ожидаемой молекулярной массе подтвердила их олигомерное состояние. Эктопически выраженный дикий тип MxA мигрировал в виде тетрамера. Эти рекомбинантные белки затем были использованы для оценки олигомерного состояния эндогенного белка MxA человека, полученного из стимулированных интерфероном-альфа клеток A549.

В результате было выявлено, что размер MxA в лизатах стимулированных интерферон-альфа клеток А549 соответствует тетрамеру. После освоения этой техники ее можно сделать за полтора дня, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя замораживать и размораживать образцы в течение всей процедуры, так как это может нарушить белковые взаимодействия или вызвать агрегацию белков.

Кроме того, при работе со светочувствительными реагентами, такими как йодоацетамид, важно защищать образцы от света на этапе лизиса. Вслед за неденатурирующим SDS-PAGE могут быть выполнены другие методы, такие как экстракция белкового геля и ферментативная активность AsiS или PAGE второго измерения, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как ферментативная активность и характеристика потенциальных гетероолигомерных комплексов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению состава олигомерных белковых комплексов в культивируемых клетках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить клеточные лизаты из клеточных культур для исследования олигомерных белков в неденатурирующем PAGE-анализе. Не забывайте, что работа с йодоацетамидом может быть чрезвычайно опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защиты глаз.