Возмущения Циркулирующие микроРНК при синдроме раздраженного кишечника Обнаружен Использование Multiplexed высокой пропускной способностью экспрессии генов платформы

Общая цель этого мультиплексного протокола количественного определения нуклеиновых кислот заключается в цифровом количественном определении экспрессии микроРНК в цельной крови. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении расстройств пищеварения. Это помогает в идентификации нерегулируемых молекулярных механизмов и сигнатур биомаркеров, таких как микроРНК.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что количественное определение микроРНК не зависит от амплификации. Эта технология подсчитывает молекулярные мишени в цифровом виде и в значительной степени автоматизирована. Чтобы очистить общую РНК, разморозьте и инкубируйте ранее собранные и замороженные образцы цельной крови в течение двух часов.

Используйте качающийся ротор ведра для центрифугирования пробирок при 5000 g при комнатной температуре в течение десяти минут. Затем удалите надосадочную жидкость, осторожно вылив или пипетировав ее в пробирку для отходов, стараясь не потревожить гранулы. Добавьте в гранулу четыре миллилитра воды, не содержащей РНКазы.

Надежно закройте крышку и вортите до тех пор, пока гранула заметно не растворится. Затем снова центрифугируйте пробирку и удалите надосадочную жидкость. Далее добавьте в гранулу 350 микролитров буфера BM1 и делайте вихрь до тех пор, пока гранула заметно не растворится.

Затем перенесите образец в двухмиллилитровую технологическую пробирку для автоматизированной полной экстракции РНК. Используя коммерчески доступный набор для экстракции РНК, проведите автоматическую очистку внутриклеточной РНК, включая микроРНК из образца цельной крови, загрузив предварительно загруженные наконечники для пипеток, центрифужные пробирки, буферы и реагенты, предоставленные в наборе для очистки РНК, в роботизированную систему экстракции РНК. В меню выбора протоколов выберите протокол Blood miRNA PartA и начните прогон.

Завершите экстракцию РНК и сохраните образцы в соответствии с текстовым протоколом. Подготовьте образцы микроРНК, сначала используя воду, не содержащую РНКазы, чтобы нормализовать 12 образцов РНК до 33 нанограммов на микролитр. С помощью воды, не содержащей нуклеаз, приготовьте разведение микроРНК в соотношении 1 к 500, входящего в набор для анализа, и держите на льду.

Затем приготовьте мастер-смесь для отжига, смешав 13 микролитров буфера для отжига, 26 микролитров реагента micro R-tag и 6,5 микролитров контрольных микроРНК. К каждой из 12 пробирок с полосками объемом 0,2 миллилитра добавьте по 3,5 микролитра мастер-смеси для отжига, а затем добавьте 3 микролитра образца РНК. Переведите пробирки для смешивания, уменьшите их в 2000 раз с помощью настольной мини-микроцентрифуги и запустите пробирки в термоамплификаторе с помощью следующей программы.

Далее приготовьте мастер-смесь для лигирования, соединив три микролитра буфера для лигирования и 19,5 микролитров ПЭГ. Затем добавьте по 2,5 микролитра мастер-смеси лигирования в каждую из реакций. После смешивания и раскрутки трубочек верните их в термоамплификатор при температуре 48 градусов Цельсия на пять минут.

Затем добавьте по одному микролитру лигазы непосредственно в каждый образец, еще находясь в блоке термоамплификатора, и инкубируйте пробирки по следующей программе. Аккуратно перемешайте и открутите пробирки и добавьте один микролитр очищающего фермента лигирования в каждый образец. Затем инкубируйте пробирки в термоамплификаторе, как показано здесь.

После инкубации добавьте в образцы 40 микролитров воды, не содержащей РНКазы, прежде чем смешивать и вращать их. Чтобы провести гибридизацию микроРНК, разморозьте репортер и наборы зондов захвата, предоставленные на льду, и раскрутите их. Добавьте 130 микролитров буфера для гибридизации в набор кодов Reporter Code Set 2 и перемешайте, чтобы создать мастер-микс для гибридизации.

В 12 новых пробирок с полосками объемом 0,2 миллилитра добавьте 20 микролитров мастер-смеси для гибридизации. Денатурируйте только что приготовленные образцы микроРНК при температуре 85 градусов Цельсия в течение пяти минут и охладите их на льду. Затем добавьте 5 микролитров образцов микроРНК в каждую из полосковых пробирок, содержащих мастер-смесь для гибридизации.

Запрограммируйте термоамплификатор на температуру 65 градусов Цельсия при температуре 30 микролитров, рассчитанной по объему, а крышку с подогревом — на время «Навсегда», чтобы она не упала до 4 градусов Цельсия в конце прогона. Добавьте по 5 микролитров набора зонда захвата в каждую пробирку и перемешайте. Затем, раскрутив их вниз, сразу же поместите трубки в термоамплификатор при температуре 65 градусов Цельсия.

Инкубируйте образцы не менее 12 часов и не более 30 часов. Настройте станцию подготовки, предварительно нагрев картридж и пластины до комнатной температуры. Затем закрутите тарелки вниз.

Чтобы загрузить станцию подготовки, откройте дверцу станции и загрузите пластины с реагентами, картридж, наконечники для пипеток, подготовленные образцы в пробирки объемом 0,2 миллилитра, а также две пустые 12-трубочные пробирки объемом 0,2 миллилира в соответствующие места в роботе. Снимите крышки полосковых пробирок и крышку пластины с реагентом. Затем закройте дверцу подготовительной станции и запустите соответствующий анализ с панели управления.

Для визуализации и подсчета штрих-кодов иммобилизованных и ориентированных трехсторонних комплексов необходимо извлечь картридж из преп-станции, с помощью прилагаемой крышки запечатать его и поместить в цифровой анализатор в любой доступный слот. Используйте сенсорный экран для создания файла определения картриджа или CDF. Убедитесь, что каждому образцу в CDF назначен соответствующий файл библиотеки reporter.

После завершения сканирования загрузите файлы данных с цифрового анализатора с помощью USB-накопителя или по электронной почте перед обработкой и анализом данных в соответствии с соответствующим протоколом контроля качества и анализа. Система анализа платформы экспрессии генов снижает технический шум благодаря своей высокоавтоматизированной природе, а уникальная химия, которую она использует, позволяет получать высокоточные данные об экспрессии генов. Показанные здесь технические реплики демонстрируют возможную высокую воспроизводимость количественного определения экспрессии как эндогенных, так и вирусных микроРНК.

Используя этот метод, вирусно-кодируемые и эндогенные микроРНК человека, которые демонстрируют отклонение от ожидаемой экспрессии, определенной здоровыми участниками исследования, могут быть идентифицированы как мишени, представляющие интерес при СРК. Точность и чувствительность метода позволяют обнаруживать возмущения среди целей с низкой экспрессией, а также надежно наблюдать тонкие возмущения. Эти цифры показывают некоторые нарушения в циркулирующих микроРНК при СРК и подтипах СРК по сравнению со здоровыми контрольными группами.

Здесь представлены две наиболее значимые дифференциально повышенные микроРНК у участников СРК. Кривые на этом графике для скрипки показывают частоту подсчета для miR-150. Вертикальные столбцы представляют первый и третий квартили, а красный квадрат указывает на медианное количество.

После этой процедуры могут быть выполнены более целенаправленные пользовательские анализы, основанные на той же технологии, чтобы проверить сигнатуры биомаркеров в больших когортах и исследовать основные ассоциации РНК и белков. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биомедицинских исследований, чтобы быстро, с точностью и аккуратностью разработать диагностические панели биомаркеров заболеваний.