Возмущения Циркулирующие микроРНК при синдроме раздраженного кишечника Обнаружен Использование Multiplexed высокой пропускной способностью экспрессии генов платформы

Общая цель данного протокола мультиплексного количественного определения нуклеиновых кислот заключается в цифровом количественном определении экспрессии микроРНК в цельной крови. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы при изучении заболеваний пищеварительной системы. Он способствует выявлению нарушенных молекулярных механизмов и биомаркерных профилей, таких как микроРНК.

Основным преимуществом данного метода является то, что количественное определение микроРНК не зависит от амплификации. Эта технология осуществляет цифровой подсчет молекулярных мишеней и в значительной степени автоматизирована. Для очистки тотальной РНК разморозьте и инкубируйте предварительно собранные и замороженные образцы цельной крови в течение двух часов.

Используйте ротор с навесными стаканами для центрифугирования пробирок при 5,000 ×g при комнатной температуре в течение десяти минут. Затем удалите супернатант, осторожно слив его или перенеся пипеткой в пробирку для отходов, стараясь не задеть осадок. Добавьте к осадку четыре миллилитра воды, не содержащей РНказы.

Плотно закройте пробирку крышкой и перемешайте на вортексе до полного растворения осадка. Затем снова центрифугируйте пробирку и удалите супернатант. После этого добавьте к осадку 350 microliters буфера BM1 и перемешайте на вортексе до полного растворения осадка.

Затем перенесите образец в пробирку для обработки объемом 2 мл для автоматизированного выделения тотальной РНК. Используя имеющийся в продаже набор для экстракции РНК, проведите автоматизированную очистку внутриклеточной РНК, включая микроРНК из образца цельной крови, установив в роботизированную систему экстракции РНК предварительно заполненные наконечники для пипеток, центрифужные пробирки, буферы и реагенты, входящие в набор для очистки РНК. В меню выбора протоколов выберите протокол Blood miRNA PartA и запустите процесс.

Завершите экстракцию РНК и храните образцы в соответствии с текстовым протоколом. Подготовьте образцы микроРНК, предварительно используя воду, свободную от РНКаз, для нормализации 12 образцов РНК до концентрации 33 нанограмм на микролитр. Используя воду, свободную от нуклеаз, приготовьте разведение 1:500 контролей микроРНК, входящих в набор для анализа, и держите их на льду.

Затем приготовьте мастер-смесь для отжига, объединив 13 µL буфера для отжига, 26 µL реагента micro R-tag и 6,5 µL контролей микроРНК. В каждую из 12 стриповых пробирок объемом 0,2 мл добавьте 3,5 µL мастер-смеси для отжига, а затем добавьте 3 µL образца РНК. Перемешайте содержимое пробирок легким постукиванием, осадите жидкость при 2000 ×g в настольной мини-микроцентрифуге и поместите пробирки в амплификатор, используя следующую программу.

Далее приготовьте мастер-смесь для лигирования, смешав 3 µL буфера для лигирования и 19,5 µL PEG. Затем добавьте по 2,5 µL мастер-смеси для лигирования в каждую из реакционных пробирок. После перемешивания и центрифугирования пробирок поместите их обратно в термоциклер при 48 °C на пять минут.

Затем добавьте один µL лигазы непосредственно в каждый образец, пока они находятся в блоке амплификатора, и инкубируйте пробирки согласно следующей программе. Осторожно перемешайте содержимое и центрифугируйте пробирки, после чего добавьте один µL фермента для очистки после лигирования в каждый образец. Затем инкубируйте пробирки в амплификаторе, как показано здесь.

После инкубации добавьте в образцы 40 µL воды, свободной от РНказ, затем перемешайте и центрифугируйте их. Для проведения гибридизации микроРНК разморозите на льду предоставленные наборы репортерных и захватывающих зондов, после чего центрифугируйте их. Добавьте 130 µL гибридизационного буфера к набору Reporter Code Set 2 и перемешайте для приготовления мастер-микса для гибридизации.

В 12 новые стрип-пробирки объемом 0.2 мл добавьте по 20 µL мастер-смеси для гибридизации. Денатурируйте только что подготовленные образцы микроРНК при 85 °C в течение пяти минут, затем охладите их на льду. После этого добавьте по 5 µL образцов микроРНК в каждую стрип-пробирку с мастер-смесью для гибридизации.

Запрограммируйте термоциклер на 65 °C, рассчитав температуру для объема 30 µL, и установите heated lid в режим Forever, чтобы по окончании цикла температура не опустилась до 4 °C. Добавьте по 5 µL набора захватывающих зондов в каждую пробирку и перемешайте. Затем, после центрифугирования, немедленно поместите пробирки в термоциклер при 65 °C.

Инкубируйте образцы не менее 12 часов и не более 30 часов. Подготовьте рабочую станцию, предварительно доведя картридж и планшеты до комнатной температуры. Затем центрифугируйте планшеты.

Чтобы загрузить станцию подготовки, откройте дверцу станции и поместите планшеты с реагентами, картридж, наконечники для пипеток, подготовленные образцы в стриповых пробирках объемом 0.2 milliliter и две пустые стриповые пробирки на 12 лунок объемом 0.2 milliliter в соответствующие слоты робота. Снимите крышки со стриповых пробирок и крышку с планшета с реагентами. Затем закройте дверцу станции подготовки и запустите соответствующий анализ с помощью панели управления.

Для визуализации и подсчета штрихкодов иммобилизованных и ориентированных трипартитных комплексов извлеките картридж из станции подготовки, закройте его provided крышкой и поместите в любой свободный слот цифрового анализатора. Используя сенсорный экран, создайте файл определения картриджа (CDF). Убедитесь, что каждому образцу в CDF назначен соответствующий файл библиотеки репортеров.

По завершении сканирования загрузите файлы данных с цифрового анализатора на USB-накопитель или по электронной почте, после чего приступайте к обработке и анализу данных в соответствии с соответствующим протоколом контроля качества (QC) и анализа. Система анализа платформы экспрессии генов снижает уровень технического шума благодаря высокой степени автоматизации, а используемая в ней уникальная химия обеспечивает получение высокоточных данных об экспрессии генов. Представленные здесь технические повторности демонстрируют возможность достижения высокой воспроизводимости при количественном определении экспрессии как эндогенных, так и вирусных микроРНК.

Используя данный метод, можно выявить вирусные и эндогенные микроРНК человека, экспрессия которых отклоняется от ожидаемой (определенной на основе показателей здоровых участников исследования), и рассматривать их как значимые мишени при СРК. Точность и чувствительность метода позволяют обнаруживать изменения даже среди низкоэкспрессируемых мишеней, а также надежно фиксировать незначительные отклонения. На этих рисунках представлены некоторые изменения циркулирующих микроРНК при СРК и его подтипах по сравнению со здоровым контролем.

Здесь представлены две микроРНК с наиболее значимым повышенным уровнем экспрессии у участников с СРК. Кривые на данной скрипичной диаграмме отображают частоту количественных показателей для miR-150. Вертикальные линии соответствуют первому и третьему квартилям, а красный квадрат указывает медианное значение.

После выполнения данной процедуры можно провести более узконаправленные специализированные анализы на базе той же технологии для валидации биомаркерных сигнатур в более крупных когортах и изучения основных ассоциаций между РНК и белками. После разработки этот метод позволил исследователям в области биомедицины быстро, с высокой прецизионностью и точностью разрабатывать диагностические панели биомаркеров заболеваний.