Нейрофармакологических Манипуляция сдержанным и свободно летающих пчел мед, Apis MELLIFERA

Общая цель этих процедур заключается в надежном и устойчивом введении фармакологических средств в центральную нервную систему медоносных пчел или подобных насекомых. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области социобиологии, нейроэтологии и пчеловодства, такие как изучение нейромеханизмов социального поведения. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют изучать нейробиологию на немодельных организмах, таких как медоносная пчела, где генетические инструменты в настоящее время ограничены.

Проводить процедуру будет Дженни Плат, аспирант из лаборатории нейроэтологии в Университете Маккуори. Препараты можно вводить перорально или инъекционно. Инъекции могут быть сделаны в грудную клетку, в глазной мозг или в глазной тракт.

Инъекции Ocellus доставляют лекарства ко всей голове, а инъекции в глазной тракт нацелены на определенные области мозга. Для всех инъекций делайте микроскальпель, отломив угол обоюдоострого лезвия бритвы с держателем лезвия. Прикрепите фрагмент лезвия к держателю лезвия так, чтобы получилось красивое лезвие с острым концом.

Для грудной инъекции рассекайте двухмиллиметровое отверстие чуть выше щитка, рядом с задним крыльевым отростком грудной клетки пчелы. Избегайте резки слишком глубоко, так как это может повредить летные мышцы, и будьте осторожны, чтобы избежать шарниров крыла. В идеале нужно резать только с трех сторон, чтобы лоскут кутикулы можно было позже отогнать, чтобы закрыть место травмы.

Теперь введите препарат в грудную клетку. Затем переместите лоскут кутикулы обратно в отверстие, и через десять часов он снова прикрепится и запечатается. Чтобы получить доступ к мозгу, зафиксируйте голову запряженной пчелы на месте, заполнив щель шеи нагретым вручную зубным воском, чтобы избежать повреждения обонятельных рецепторов антенн или других клеток, которые могут быть важны для поведения пчелы.

Антенна также может быть заблокирована стоматологическим воском. Затем с помощью микроскальпеля осторожно извлеките хрусталик срединного глазка, вставив кончик микроскальпеля под хрусталик и аккуратно отделив хрусталик от капсулы головки. Чтобы препарат попал во всю капсулу головки, осторожно нанесите препарат пипеткой на отверстие глазного яблока и подождите, пока он впитается внутрь.

В качестве альтернативы субрегионы мозга могут быть нацелены путем инъекции через глазной тракт, например, путем введения 250 нанолитров препарата на глубину 50 микрон в целевые структуры мозга, прилегающие к глазному трактусу. Затем удалите зубной воск и дайте пчеле немного отдохнуть, прежде чем продолжить экспериментальную процедуру. Для приготовления инъекционных игл вытяните за одну миллиметровую стеклянную трубку, чтобы получить наконечник длиной примерно 0,5 сантиметра.

Далее под стереомикроскопом ломаем кончики, чтобы сделать отверстие наружным диаметром примерно от 10 до 15 микрон. Это можно измерить с помощью весов на градусной сетке. Теперь загрузите раствор препарата в инъекционную иглу.

Затем в системе инъекций приложите заряженную инъекционную иглу к микроманипулятору. Протестируйте систему впрыска в минеральном масле и откалибруйте ее для подачи болюса объемом от 0,5 до двух нанолитров в зависимости от размера целевой структуры мозга. С помощью градусной сетки измерьте диаметр капелек, чтобы рассчитать их объем.

Для фиксации головы запряженной пчелы используют мягкий зубной воск, как и раньше. Затем прорежьте отверстие в передней части капсулы головы с помощью микроскальпеля с тремя надрезами: один чуть ниже срединного глазного яблока; один на границе правого или левого глаза; и один над стеблями антенны. Используйте кусочек стоматологического воска, чтобы удерживать открытый лоскут на месте.

Далее осторожно отодвиньте железы и трахею с помощью тонких щипцов и сделайте небольшой разрыв в нейрилемме над целевой структурой мозга. Теперь вставьте кончик стеклянной пипетки в нужную область мозга, в идеале, перпендикулярно поверхности мозга на необходимую глубину, чтобы добраться до целевой структуры. Затем вводят препарат болюсно.

При нацеливании на парные области мозга сделайте по одной инъекции в каждое полушарие, чтобы воздействовать на оба полушария. Если ввести флуоресцентный краситель вместе с болюсом, поверхностные участки мозга можно увидеть с помощью флуоресцентного света. Другие участки могут быть проверены позже с помощью конфокальной микроскопии.

После инъекции замените лоскут кутикулы и запечатайте срез, расплавив кристалл эйкозана диаметром примерно один миллиметр над кутикулой с помощью тонкой проволоки, прикрепленной к микропаяльнику. Это значительно снизит смертность. Для введения препарата такой же летучий, как из нагретой нихромовой нити, готовят его растворенным в чистом этаноле.

Чтобы аккуратно просверлить отверстия в крышке 50-миллиметровой трубки, проведите два провода через отверстия. Чтобы создать филамент, плотно намотайте нихромовую проволоку на гвоздь, присоедините нихромовую проволоку к двум электрическим проводам, а затем снимите ноготь. После этого закрепите провода и заклейте отверстия силиконом.

Теперь подключите провода к источнику питания. И используйте термопару для измерения температуры нити накаливания. Чтобы откалибровать устройство, осторожно нанесите на нить два микролитра раствора препарата и дайте этанолу полностью испариться при комнатной температуре.

Изменяйте напряжение в токе таким образом, чтобы препарат улетучивался в течение десяти секунд после подачи питания. Препарат не должен разрушаться путем термического разложения. Осадок обычно можно увидеть на сухой нити при тщательном осмотре.

Чтобы доставить препараты пчеле, загрузите в трубку свободно летающую или запряженную пчелу и аккуратно прикрепите крышку проводами наружу. Затем включите источник питания на 10 секунд и подождите еще 50 секунд, пока испаряющееся соединение полностью впитается пчелой, прежде чем удалять пчелу. Специфическое воздействие на мозговые процессы может быть легко получено после инъекции грудной клетки.

Например, блокаторы транскрипции вводились с использованием этой техники для идентификации фаз памяти, требующих экспрессии генов. Получены селективные и зависящие от времени воздействия на задачи памяти. Диффузия молекул в гемолимфу головы приводит к быстрым, дозозависимым эффектам, достигаемым при инъекции оцеллуса.

При определенных концентрациях в дозах диффузно-концентрированные аллатастатины снижали эффективность в анализе на обонятельное обучение. Чтобы проверить пространственные и временные свойства конкретных областей мозга, обузданных пчел обучали в парадигме обонятельного обусловливания PER, а затем вводили прокан в чашечки тела гриба, или вертикальные доли. Когда пчел затем проверяли на отзывчивость, производительность была нарушена только у пчел, введенных двусторонним способом.

На арене с несколькими кормушками пчелы были аккуратно пойманы, когда они собирались выйти из кормушки с одним моляром сахарозы. Пойманных пчел обрабатывали 100 микрограммами испаряющегося кокаина, что приводило к увеличению сбора пищи на половинных молярах, но не на двух молярах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вводить препараты свободно летающим или сдержанным пчелам путем инъекции или испарения.

После освоения эти методы можно легко проделать на большом количестве пчел за пару часов. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как обусловливание удлинения хоботка, чтобы мы могли ответить на дополнительные вопросы о нейробиологии обучения и памяти.