Мышиной модели группы B Streptococcus Вагинальный Колонизация

Общая цель этой животной модели состоит в том, чтобы установить стрептококк группы В, или колонизацию СГБ влагалищного тракта мышей. Этот метод может помочь нам понять ключевые вопросы о колонизации стрептококком группы В, такие как какие бактериальные факторы важны для колонизации, а также как реакции хозяина влияют на вагинальную персистенцию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что инокуляция, как правило, приводит к более чем 90-процентной колонизации без использования анестезии, иммунодепрессантов или загустителей.

Начните с вортексирования 0,5 миллиграмма бета-эстрадиола на мышь в конической трубке объемом 15 миллилитров до тех пор, пока все комки не будут удалены и бета-эстрадиол не превратится в виде мелкого порошка. Затем отфильтруйте из шприца 100 микролитров кунжутного масла на каждую мышь в трубку через сетчатое фильтр 0,45 микрона и снова переведите трубку в заворот. Когда гормон распределится в виде однородной суспензии по всему маслу, наберите реагент в новый шприц объемом 10 миллилитров и прикрепите иглу 18 калибра, диаметр в один дюйм.

Внесите 100 микролитров суспензии в один миллилитровый туберкулиновый шприц на каждую мышь и снабдите каждый туберкулиновый шприц стерильной иглой 26 калибра в полдюйма. Затем доставьте 100 микролитров бета-эстрадиола в нижний левый или правый квадрант брюшинной полости каждого животного. В тот же день, что и инъекция, вырастите пятимиллилитровую жидкую культуру интересующего штамма GBS в бульоне Тодда Хьюитта, или THB, при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующее утро субкультурируйте GBS в объеме от одного до 10 в свежем THB в течение двух-трех часов инкубации при 37 градусах Цельсия, пока бактерии не достигнут средней фазы логарифма. Затем перенесите субкультуру в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте бактериальные клетки. Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах стерильного PBS.

Затем доведите общий объем суспензии до одного миллилитра PBS на 10 мышей, чтобы достичь OD600 0,4 в новой, пятимиллилитровой культуральной пробирке. Переложите культуру в новую, 15-миллилитровую пробирку, и повторно гранулируйте бактерии. Затем ресуспендируйте клетки в PBS на одну десятую от первоначального объема.

Зарезервируйте 50 микролитров бактерий для серийного разведения и нанесения на THB-агара, чтобы определить точное КОЕ инокулюма. Затем наберите 10 микролитров GBS в 200 микролитров гелеобразного наконечника пипетки и вручную закрепите дряблую кожу на загривке шеи первого животного между большим и указательным пальцами, после чего обездвижьте хвост. Введите наконечник пипетки на 5-10 миллиметров в просвет влагалища и распределите весь объем инокулята.

Затем сразу отпустите загривок и поднимите хвост, чтобы приподнять задний конец животного, при этом передними лапами ходите по твердой поверхности. Через минуту визуально осмотрите вход во влагалище на предмет обратного потока инокулюта. Непосредственно перед взятием мазка смочите вату в PBS и удерживайте одну из мышей, как показано выше.

Введите тампон на 10 миллиметров в просвет влагалища, и аккуратно поверните четыре раза по часовой стрелке, и четыре раза против часовой стрелки, при этом слегка надавливая на стенку влагалища. Поместите тампон в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 100 микролитров PBS, и закрутите трубку и тампон примерно на 15 секунд, чтобы выпустить бактерии из хлопковых волокон. Затем последовательно разведите каждый образец в PBS и нанесите 20 микролитров от одного до 10 до 10 000 разведений на агаровую пластину с дифференциальной средой, приготовленную в соответствии с инструкциями производителя, для инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов.

Колонии GBS будут иметь ярко-розовый или лиловый цвет. Для сбора вагинального промывания с помощью 200 микролитров гелеобразного наконечника для пипетки введите 20 микролитров PBS в просвет влагалища. Аккуратно пипетируйте весь объем вверх и вниз четыре раза в пределах просвета.

Затем, используя ту же подсказку, вывести весь объем. Для последующего анализа жидкости для лаважа раздайте его в микроцентрифужную пробирку объемом 0,7 миллилитра. Для гомогенизации диссекции тканей распылите на брюшную полость усыпленного животного 70 процентов этанола и используйте стерильные ножницы, чтобы открыть брюшную полость.

Сместите кишечник так, чтобы обнажился репродуктивный тракт. Затем разрежьте оба маточных рога, средней длины, между телом матки и яичниками. С помощью ножниц и щипцов отделите висцеральный жир, оболочки и мочевой пузырь от репродуктивных путей, перемещая ткани каудально.

Затем поперечно разрежьте влагалище как можно ближе к вульве, чтобы отделить репродуктивные пути от тела. Перенесите поврежденный репродуктивный тракт в стерильную чашку Петри и используйте новое лезвие бритвы, чтобы отделить матку от шейки матки одним поперечным разрезом. Отделите шейку матки от влагалища еще одним поперечным надрезом.

Затем с помощью стерильных щипцов переведите каждую из тканей в отдельные, предварительно взвешенные, два миллилитровых пробирки, содержащие 500 микролитров PBS и гомогенизирующие гранулы. Взвесьте каждую трубку объемом 2 миллилитра, чтобы определить вес ткани. Затем плотно запечатайте пробирки с винтовой крышкой и гомогенизируйте ткани в течение одной минуты на максимальной скорости в гомогенизаторе тканей.

Чтобы количественно оценить бактериальную нагрузку, последовательно разбавляйте 25 микролитров гомогената тканей и наносите в тарелки от 1 до 10 до 10 000 разведений на агаровых планшетах с дифференциальной средой для 24-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия. Для хранения образцов для количественного определения цитокинов гомогенаты заморозьте при температуре минус 20 градусов Цельсия. На этих изображениях показаны четыре стадии цикла течки мыши, определяемые жидкостью влажного вагинального лаважа.

Мыши, инокулированные на стадии проэструса, были колонизированы СГБ дольше, чем на любой другой стадии течки, особенно те, которые находились в диэструсе во время инокуляции. Устойчивая течка способствует персистенции GBS A909 у мышей с CD-1 с 90-процентной колонизацией, наблюдаемой через две недели после инокуляции. В типичном эксперименте с одной дозой бета-эстрадиола перед инокуляцией только от 40 до 50 процентов мышей были колонизированы через неделю после инокуляции, при этом восстановленный средний СГБ имитировал процент колонизации.

Демонстрация того, что поддержание непрерывной течки способствует вагинальной персистенции СГБ у большинства мышей с CD-1. GBS A909 сохраняется во влагалищном тракте у аутбредных мышей CD-1 и инбредных мышей FVB в течение примерно одной недели. В то время как большинство инбредных мышей BALB/c и C57BL/6 колонизируются в течение одной недели на месяц или дольше.

Визуализация GFP-положительного СГБ у инокулированных животных демонстрирует наличие СГБ, прикрепленного к эпителию влагалища мыши и находящегося в непосредственной близости от другой местной флоры влагалища. Важно предотвратить обратный поток во время инокуляции, чтобы гарантировать, что все мыши колонизируются. После освоения эта техника может быть выполнена за один-два часа, в зависимости от количества животных.

Эта модель позволяет исследователям в области взаимодействия хозяина и патогена изучить способность бактерий, таких как стрептококк группы В, колонизировать женский репродуктивный тракт. Эта процедура может быть использована для тестирования новых соединений или пробиотических препаратов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о терапевтических вмешательствах.