обнаружение Trypanosoma brucei Вариант поверхности гликопротеин Переключение с помощью магнитных Активированный сортировки клеток и проточной цитометрии

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать трипаносомы, экспрессирующие определенный вариант поверхностного гликопротеина или VSG, от остальной популяции и идентифицировать паразитов, которые переключились с исходного доминантного VSG на любой другой VSG. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии трипаносом, например, какие факторы или события влияют на переключение VSG в популяции паразитов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он быстрее, чем ранее опубликованные методы, и позволяет легко количественно оценить количество переключаемых и непереключаемых ячеек.

Когда лаборатория впервые начала работать над антигенной изменчивостью, первая проблема заключалась в том, как обнаружить редкие переключатели. Такого рода проблема была решена в иммунологии несколько лет назад с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток для обогащения клеток, которые были отрицательными по определенному признаку. Перенос процесса неотбора на антигенную изменчивость казался действительно многообещающей идеей.

Для начала трипаносом крови штамма Lister 427 следует вырастить до плотности от 0,5 до 100 000 на миллилитр. Аликвотируйте образец из 50 умножить на 10 на шесть клеток в пробирку объемом 15 миллилитров, а затем центрифугировать. Оставьте от одного до 10 до шести клеток и культуры для использования в дальнейшем в качестве положительного и отрицательного контроля антител.

Отпижите большую часть надосадочной жидкости, оставив в пробирке примерно 750 микролитров. Переложите ячейки в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Наконец, центрифугируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех минут при 2800 умноженных на избление.

А затем отпижьте пипеткой всю надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 150 микролитрах питательной среды, а также первичные антивариантные поверхностные гликопротеиновые антитела или анти-VSG в соответствующем разведении. Далее сделайте вихрь в клетках при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.

Промойте от 800 до 1000 микролитров холодной питательной среды. Центрифугируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех минут при 5200 умноженных на избление. После аспирации надосадочной жидкости промойте клетки одним миллилитром питательной среды и снова центрифугируйте.

Снимите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах питательной среды. Добавьте 110 микролитров магнитно-активируемых микрогранул для сортировки клеток соответствующего типа для первичного антитела. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, а затем вортс.

Пока клетки находятся в завихрениях, установите разделяющую колонку, активируемую магнитами. Поместите под него 15-миллилитровую трубку, чтобы собрать грунтовочную среду. Добавьте два миллилитра питательной среды, чтобы загрунтовать колонку.

Далее извлеките образец из вихря и добавьте от 800 до 1000 микролитров холодной питательной среды. Центрифугируйте образец, а затем удалите надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанные антитела. Гранулированные клетки промыть одним миллилитром питательной среды и снова центрифугировать.

На этот раз отсадите надосадочную жидкость, но оставьте в пробирке 100 микролитров. Энергично поворачивайте трубку центрифуги, пока гранула полностью не будет суспензирована. Добавьте один миллилитр питательной среды и пипеткой вверх и вниз для полного суспендирования клеток.

Снимите 15-миллиметровую коническую трубку, используемую для сбора грунтовочной среды, и замените ее новой 15-миллилитровой конической трубкой для сбора проточного потока, содержащего переключившихся паразитов. Нанесите клеточную суспензию на загрунтованный столбик. Соберите проточный поток в 15-миллилитровую трубку ниже, что обычно занимает от шести до семи минут для одного миллилитра среды плюс трипаносомы.

Далее дважды промойте колонку одним миллилитром питательной среды и соберите проточную в ту же пробирку. Разделите проточную трубку, которая в сумме должна составить примерно три миллилитра, на две микроцентрифужные пробирки по 1,5 миллилитров. Затем поместите трубки на лед.

Добавьте в колонку три миллилитра питательной среды и погрузите колонку в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Таким образом, будут получены клетки, экспрессирующие исходный доминантный VSG. Удалите 300 микролитров этого элюированного материала и держите его на льду, остальное можно выбросить.

Чтобы создать положительный контроль, возьмите примерно 100 000 клеток из исходной культуры клеток и пипетируйте их в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Повторите это для создания отрицательного контроля. Центрифугируйте проточные проточные пробы и положительную контрольную пробу.

А затем удалить и выбросить надосадочную жидкость. Ресуспендируйте положительные контрольные клетки в 100 микролитрах питательной среды первичными антителами против VSG, меченными флуорофорами, в соответствующем разведении. Затем ресуспендируют одну проточную гранулу в 100 микролитрах питательной среды с первичным меченым флуорофором антителом против VSG в соответствующем разведении .

Затем используйте суспензию для ресуспендирования гранул во второй проточной трубе, в результате чего получится одна трубка для бассейна. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Обработайте клетки вихрем, а затем добавьте от 800 до 1000 микролитров холодной питательной среды.

Центрифугируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех минут при 5200 умноженных на g, а затем выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить все несвязанные антитела. Промойте клетки одним миллилитром питательной среды, затем центрифугируйте клетки. Положительный и отрицательный контроль, а также элюированные клетки, ранее хранившиеся на льду.

Выбросьте надосадочную жидкость. После этого добавьте к образцам 148,5 микролитров питательной среды. Далее добавьте 25 микролитров абсолютных счетных шариков, а затем 1,5 микролитра раствора для окрашивания Propidium Iodide.

Суспендируйте положительные и отрицательные контрольные гранулы 175 микролитрами питательной среды. Теперь образцы можно запускать на проточном цитометре. Эти графики проточной цитометрии показывают результаты отделения клеток от популяций трипаносом, индуцированных для создания двухцепочечного разрыва ДНК по сравнению с неиндуцированными клетками.

На левых панелях показано разброс вперед и в сторону, что позволяет пролить свет на живые и мертвые клетки и гранулы, добавленные в образец. Затем могут быть сгенерированы вентили, которые определяют их на основе характеристик разброса. На правых панелях отображаются только те ячейки, которые могут быть классифицированы как активные на основе элементов рассеивания, сгенерированных на левых панелях.

Доминирующей стартовой VSG в этом случае была вторая VSG. Клетки, которые положительно окрашиваются на йодид пропидиума, являются мертвыми клетками. И они видны в областях Q one и Q two на графике.

Клетки, которые окрашиваются положительно на доминантный VSG и отрицательно на PI, попадают в область Q 3 и являются загрязнителями. Наконец, клетки в Q 4 являются живыми клетками, которые окрашиваются отрицательно для доминантного VSG и считаются переключателями. На этом графике показаны рассчитанные наблюдаемые частоты переключения популяций трипаносом с индуцированными разрывами по сравнению с такими.

Уровень стохастического переключения in vitro достаточно низкий. В то время как индуцирование разрыва приводит к значительному увеличению количества клеток, переключение на недоминантный VSG. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за три часа.

При выполнении этой процедуры важно сохранять образцы в холоде на протяжении всего времени и адекватно ресуспендировать гранулы, особенно перед изоляцией на колонне. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как секвенирование РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие VSG экспрессируются в популяции переключателя. Этот метод обычно используется для измерения переключения VSG, он также может быть использован для выделения и количественного определения паразитов, экспрессирующих любой поверхностный белок, представляющий интерес.