Анализ белка импорта в хлоропласты, выделенных из растений стрессовых

Общая цель данной методологии заключается в изучении импорта белков, кодируемых ядром, в хлоропласты с особым акцентом на эффекты стресса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хлоропластов, например, как регулируется импорт белка хлоропласта. Особое преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет оценить влияние стресса на импорт белка хлоропластов.

Хотя этот метод был разработан для использования с модельным растением Arabidopsis thaliana, он может быть модифицирован и адаптирован для использования с другими системами, такими как сельскохозяйственные культуры. Демонстрировать процедуру будет Цихуа Лин, постдок из моей лаборатории. Для начала сначала вырастите растения Arabidopsis, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Затем, когда растениям исполнится восемь дней, проведите стрессовую обработку. Аккуратно соскребите растения с агаровой пластины вручную и поместите их в стерилизованную колбу с жидкой средой MS, содержащей стрессор. Помещение дополнительных растений в аналогичную колбу без стрессора в качестве контроля также может быть необходимым, в зависимости от характера эксперимента.

Накройте горлышко колб стерилизованной пленкой и дайте растениям расти еще два дня на орбитальном шейкере с легким встряхиванием. Приготовьте непрерывный градиент плотности, сначала смешав 13 миллилитров Percoll, 13 миллилитров двух изоляционных буферов хлоропластов и пять миллиграммов глутатиона в центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте смесь.

После центрифугирования обращайтесь с пробиркой осторожно, чтобы не нарушить градиент, и держите ее на льду, чтобы использовать позже. Затем перелейте 100 миллилитров изоляционного буфера хлоропластов для каждого условия в стакан объемом один литр. Извлеките рассаду из жидкой среды, опрокинув ее в сито.

Затем переложите их в стакан, содержащий буфер для изоляции хлоропластов. Промойте ткань с помощью буфера, чтобы удалить остатки среды, а затем замените буфер 100 миллилитрами свежего изоляционного буфера. Для первого раунда гомогенизации перенесите растительную ткань в стакан объемом 50 миллилитров вручную, позволив предыдущему буферу стечь через пальцы.

Затем поместите в ткань зонд тканевого гомогенизатора и гомогенизируйте двумя импульсами по одной-две секунды каждый. Отфильтруйте гомогенат через два слоя фильтрующей ткани в центрифужную пробирку объемом 250 миллилитров. В завершение аккуратно сожмите ткань.

Сохраните фильтрат и перенесите растительную ткань обратно в стакан объемом 50 миллилитров. Затем поместите вторые 20 миллилитров изоляционного буфера хлоропластов в стакан объемом 50 миллилитров и добавьте оставшуюся ткань, которая не была использована в первом раунде гомогенизации. Повторите этапы гомогенизации и фильтрации еще четыре раза.

Центрифугируйте объединенный гомогенат при 1000 умноженных на g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Слейте надосадочную жидкость сразу после центрифугирования, стараясь не потревожить гранулу. Поместите трубку на лед и снова суспендируйте гранулу в остаточной надосадочной жидкости, осторожно помешивая трубку.

Затем с помощью пастеровской пипетки аккуратно перенесите гомогенат на верхнюю часть предварительно созданного непрерывного градиента плотности через стенку приемной трубки. Затем центрифугируйте образец и выполните градиент в качающемся роторе ведра при 7 800 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия при выключенном тормозе. Когда закончите, обратите внимание на две зеленые полосы, которые можно увидеть в градиенте.

Выбросьте верхнюю полосу, которая содержит сломанные хлоропласты, и с помощью пастеровской пипетки перенесите нижнюю полосу, содержащую неповрежденные хлоропласты, в свежую 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем добавьте в трубку 25 миллилитров буфера HMS и дважды переверните трубку, чтобы смыть Percoll от хлоропластов. Затем поместите трубку обратно в вращающийся ротор ковша и повторно гранулируйте хлоропласты.

Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в остаточном буфере, осторожно взбалтывая трубку на льду. При необходимости добавьте дополнительно от 100 до 300 микролитров буфера HMS, но старайтесь не разбавлять образец слишком сильно. Храните ресуспендированные хлоропласты на льду.

Начните с добавления пяти микролитров выделенных хлоропластов к 495 микролитрам буфера HMS в 1,5-миллилитровой пробирке. Переверните трубку, чтобы аккуратно перемешать раствор. Затем поместите покровное стекло поверх счетной камеры гемацитометра.

Медленно внесите от 40 до 60 микролитров разбавленной суспензии хлоропластов в зазор между покровным стеклом и счетной камерой. С помощью фазово-контрастного микроскопа визуализируйте хлоропласты с 20-кратным объективом. Неповрежденные хлоропласты выглядят круглыми и яркими и окружены ореолом света.

Затем используйте объектив 10x для количества хлоропластов в 10 больших квадратах. Количество хлоропластов на большую площадь должно составлять в среднем от 10 до 30. Если хлоропластов слишком мало или слишком много, отрегулируйте коэффициент разбавления и повторите процедуру.

Оказавшись в нужном диапазоне, рассчитайте количество хлоропластов на миллилитр, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Чтобы запустить временной ход с тремя временными точками, подготовьте три пробирки, каждая из которых содержит 130 микролитров аликвоты импортного буфера, и оставьте их на льду. В двухмиллилитровой пробирке приготовьте импортную реакцию, содержащую реакционный буфер и меченый радиоактивным белком-предшественником.

Обратите внимание, что для каждого тестируемого условия должна быть одна реакция. Используйте примерно 10 миллионов хлоропластов за определенный момент времени. Инкубируйте реакционную пробирку при температуре 25 градусов Цельсия на водяной бане под ограниченным количеством света.

Время от времени передергивайте трубки, чтобы снова суспендировать хлоропласты. Провести временной ход, с 130 миллилитровыми аликвотами из реакции в необходимые временные точки в пределах линейного диапазона импорта. Сразу после извлечения перелейте каждую 130 микролитровую аликвоту в тюбик с ледяным буфером для импорта, перемешанным легкими постукиваниями по трубке, и поместите пробирки на лед до тех пор, пока не завершится временной курс.

После того, как последний образец будет удален, центрифугируйте все образцы в течение 30 секунд при 12 000 g в микрофуге. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 15 микролитрах двух х белковых буферов. Затем перемешайте образцы с помощью вортекса.

Наконец, проанализируйте все образцы, а также контроль ввода прекурсора с помощью стандартного SDS-PAGE и авторадиографии, флюорографии или фосфоримации. PsaD — 18-килодальтонный компонент фотосистемы I, синтезированный как более крупный предшественник 23 килодальтон. Переработка до зрелой формы в 18 килодальтон указывает на то, что произошел импорт в хлоропласты.

Изученный здесь мутант sp1 Arabidopsis содержит дефект в важном регуляторе механизма импорта белка хлоропластов, белке sp1. В стрессовых условиях количество импорта белка PsaD в мутантные хлоропласты sp1 увеличивается по сравнению с диким типом, но не в нормальных нестрессовых условиях. В то время как зрелая белковая форма PsaD накапливалась в зависимости от времени с хлоропластами обоих растительных генотипов, скорость импорта была значительно выше для мутантных хлоропластов sp1, чем для хлоропластов дикого типа.

Эти результаты указывают на важную роль белка sp1 в регулировании импорта белка хлоропластов в условиях стресса. После освоения этот метод от выделения хлоропластов до завершения импортного анализа может быть завершен за пять-шесть часов, если он выполнен правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о проведении всех этапов выделения хлоропластов при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы гарантировать, что хлоропласты сохраняют максимальную активность.

После своего первоначального развития несколько десятилетий назад, анализ импорта белка хлоропластов in vitro проложил путь исследователям в этой области к изучению многих различных аспектов механизма импорта белка хлоропластов. Представленное здесь уточнение позволяет исследовать влияние стрессовых условий на импорт белка. Не забывайте, что работа с радиоактивными материалами требует особой осторожности.

Во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, лабораторного халата и защитных очков.