Быстрое и эффективное создание рекомбинантного человеческого плюрипотентных стволовых клеток с помощью рекомбинантному-опосредованной кассетные бирже в AAVS1 Locus

Общая цель этой процедуры заключается в выполнении быстрого и эффективного целевого редактирования генома в AAVS1 человеческих плюрипотентных стволовых клеток, или человеческих ПСК, с использованием подхода flippase, рекомбиназо-опосредованного кассетного обмена, или RMCE. RMCE улучшает встраивание последовательности в локус AAVS1, что имеет большое значение для биологии стволовых клеток, поскольку позволяет быстро тестировать функцию молекулы путем сверхэкспрессии или нокдауна. Основное преимущество этой методики заключается в том, что человеческие линии ПСК свободны от событий случайной интеграции, по-прежнему плюрипотентны и при нормальных кариотипах могут быть созданы всего за 15 дней.

Этот метод предоставляет полезный инструмент для трансгенеза в локусе AAVS1, но также может быть применен к другим пермиссивным локусам человека. Для начала культивируйте мастер-клеточные линии PSC человека в соответствии со стандартными процедурами на инактивированных эмбриональных фибробластах мышей или iMEF или их удалении в шести луночных планшетах. Когда клетки достигают 60-70% конфлюенции планшета с лекарственно-устойчивыми iMEF, сначала используя 0,1% раствор желатина, покрывают необходимые лунки 12-луночного планшета и инкубируют планшет при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем наберите 125 000 iDR4 в лунку и инкубируйте культуры в течение ночи со средой iMEF. На следующий день проводят предварительную инкубацию культур ПСХ человека со свежей средой, включая 10 микромолярного ингибитора ROCK, при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Тем временем доведите раствор для трансфекции ЭСК человека и агент для диссоциации клеток до комнатной температуры.

Приготовьте один миллилитр гальванической среды для нуклеофекции для каждого условия нуклеофекции. Затем удалите среду iDR4 из лунок, используйте один миллилитр PBS комнатной температуры для промывания клеток и добавьте среду для нанесения нуклеофекционных покрытий. Переложите 500 микролитров на образец гальванической среды в стерильные пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре 37 градусов Цельсия до нанесения покрытия.

Чтобы отделить человеческие ПСК в одноклеточной суспензии, удалите среду, используйте PBS комнатной температуры для промывания клеток и добавьте один миллилитр 0,05% трипсина или аккутазы на питающие или безпитательные культуры hPSC соответственно. Инкубируют культуры при температуре 37 градусов по Цельсию. Далее осторожно извлеките планшет из инкубатора и, не допуская отсоединения клеток, отсасывайте агент диссоциации и добавьте 1 миллилитр среды ПСК человека.

Диссоциируйте свободные ячейки, аккуратно промывая среду на поверхности пластины, избегая образования пены. Соберите клетки в одноклеточную суспензию в чистую и стерильную пробирку объемом 15 или 50 миллилитров. Затем используйте 1 миллилитр среды hESC для промывания клеток и соберите их в одну пробирку.

Возьмите 50 микролитров аликвоты клеточной суспензии для подсчета и центрифугируйте оставшиеся клетки в 300-кратном g при комнатной температуре в течение пяти минут. Подсчитайте клетки с помощью устройства для подсчета клеток, пока суспензия подвергается центрифугированию. Удалите надосадочную жидкость и используйте PBS комнатной температуры, чтобы мягко восстановить цвет клеток до 10-шестой клетки на миллилитр.

Затем переведите два миллилитра в каждом экспериментальном состоянии в чистые стерильные 15-миллилитровые пробирки и повторите центрифугирование. Пока образцы вращаются, приготовьте плазмидные смеси в трех чистых 1,5-миллилитровых пробирках с соотношением доноров флиппазы 0:1, 2:1 и 2:0 с использованием 2,5 микрограммов плазмиды флиппазы. Чтобы приступить к нуклеофекции, извлеките из инкубатора планшет iDR4 и 1,5-миллилитровую трубку с плоской средой

По одной пробирке за раз, не потревожив гранулу, осторожно отпижывайте PBS, удаляя как можно больше буфера. Используйте 100 микролитров трансфекционного раствора для ресуспендирования гранулы путем аккуратного пипетирования. Затем перенесите клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую плазмидные смеси, и аккуратно перемешайте.

Перенесите смесь ДНК клетки в кювету трэнфектора, стараясь не вводить пузырьки. Вставьте кювету в нуклеофекторное устройство и запустите программу A13 для клеток, культивируемых на питателях, или F16 для безфидерной трансфекции. Снимите кювету и с помощью одноразовых переводных пипеток из набора добавьте 0,5 миллилитра гальванической среды в кювету аккуратно, но быстро и одним движением.

Затем таким же образом рекуперируйте объем и нанесите его по каплям в 12-луночный планшет, содержащий iDR4 и гальваническую среду. Поставьте чашку для культивирования на полку в инкубаторе и медленно перемещайте ее вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клеточную суспензию. Выдержите чашку в течение 24 часов, прежде чем менять среду.

Через два-три дня после трансфекции приступайте к отбору. Аспирируйте среду, используйте 1 миллилитр PBS для промывания клеток, затем добавьте человеческую среду ESC со 100 нанограммами на миллилитр пуромицина. Наблюдайте за ростом клеток и увеличивайте концентрацию пуромицина соответственно до максимума до 250 нанограммов на миллилитр, продолжая отбор пуромицина в течение семи дней.

Через три-четыре дня после выбора пуромицина начните отбор с 0,5 микромолярного фиалуридина или FIAU. Меняйте среду ежедневно и поддерживайте FIAU не более семи дней подряд. После завершения отбора, примерно на 14-15 день, устойчивые колонии RMCE будут присутствовать и составлять новую линию RMCE.

Разделите ячейки в соотношении 1:2 в соответствии со стандартными процедурами. Когда лунки из ключа 1 будут готовы к разделению, диссоциируйте лунку для характеризации в одноклеточную суспензию, как описано ранее в видео, и соберите ячейки в 15-миллилитровую пробирку. Раскрутите ячейки при 300-кратном g при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем используйте один миллилитр PBS для ресуспендирования клеток и разделите образец на две части. Один фильтруется с помощью клеточного фильтра для проведения проточной цитометрии, а другой – для анализа ДНК по текстовому протоколу. После трансфекции с флиппазной рекомбиназой и донором tdT RMCE hPSCs образовывали небольшие группы клеток, равномерно распределенных по слою iDR4 MEF и экспрессировавших конститутивные GFP и транзиторные tdT.

Положительный отбор с использованием пуромицина благоприятствует вставке донора RMCE, затем отрицательный отбор с использованием FIAU отбирает только для опосредованных FRT рекомбинационных событий, в которых отсутствует TK. Примерно на шестой день после трансфекции могут быть идентифицированы небольшие кластеры RMCE GFP-отрицательных, tdT-положительных клеток. Как показано здесь, GFP-отрицательные, tdT-положительные колонии RMCE присутствуют только при использовании как донора RMCE, так и флиппазы, в то время как RMCE не возникает в отсутствие флиппазы. Проточная цитометрическая характеристика вновь сгенерированных линий RMCE, которые представляют собой резистентные к пуромицину и FIAU колонии RMCE, объединенные в неклональную популяцию клеток, подтверждает, что 100% клеток представляют GFP-отрицательный, tdT-положительный фенотип RMCE.

При использовании доноров RMCE без регистрирующей активности в hPSC 100% клеток являются GFP-отрицательными. Показанная здесь ПЦР-характеристика неклональной линии RMCE демонстрирует полный обмен кассетами и то, что используемая программа отбора генерирует линии без случайного интегрирования, как донора RMCE, так и экспрессирующего вектора flippase. Таким образом, этот метод RMCE значительно упрощает редактирование генов в hPSCs для определенного локуса по сравнению с нуклеазами-мишенями.

После освоения этой техники ее можно освоить за 15 дней. Таким образом, RMCE является очень быстрым инструментом редактирования генов, который позволит проводить сравнительные исследования в условиях изогенности. При использовании этой процедуры важно иметь эффективность трансфекции выше 30% и подготовить соответствующий агент для выбора основного хранилища.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять RMCE в локусе AAVS1 ПСК человека и как охарактеризовать рекомбинативную линию.