Быстрое и эффективное создание рекомбинантного человеческого плюрипотентных стволовых клеток с помощью рекомбинантному-опосредованной кассетные бирже в

Общая цель данной процедуры — выполнение быстрого и эффективного направленного редактирования генома в локусе AAVS1 человеческих плюрипотентных стволовых клеток (человеческих ПСК) с использованием метода обмена кассет, опосредованного рекомбиназой (RMCE), с применением флиппазы. RMCE улучшает точность вставки последовательности в локус AAVS1, что имеет большое значение для биологии стволовых клеток, так как позволяет быстро тестировать функцию молекулы посредством ее гиперэкспрессии или нокдауна. Основным преимуществом данного метода является возможность создания линий человеческих ПСК с нормальным кариотипом, сохранивших плюрипотентность и не имеющих событий случайной интеграции, всего за 15 дней.

Данный метод представляет собой полезный инструмент для трансгенеза в локусе AAVS1, который также может быть применен к другим пермиссивным локусам человека. Для начала культивируйте основные клеточные линии ПСК человека по стандартным процедурам на инактивированных эмбриональных фибробластах мыши (iMEF) или без них в шестилуночных планшетах. Когда клетки достигнут 60%–70% конфлюэнтности, высейте лекарственно-резистентные iMEF, предварительно используя 0,1% раствор желатина для покрытия необходимых лунок 12-луночного планшета, и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем высейте по 125 000 iDR4 на одну лунку и инкубируйте культуры в течение ночи в среде iMEF. На следующий день проведите преинкубацию культур человеческих PSC в свежей среде с добавлением 10 µM ингибитора ROCK при 37 °C в течение одного часа. Тем временем доведите раствор для трансфекции человеческих ESC и агент для диссоциации клеток до комнатной температуры.

Подготовьте по одному миллилитру среды для посева после нуклеофекции для каждого условия нуклеофекции. Затем удалите среду iDR4 из лунок, промойте клетки одним миллилитром PBS комнатной температуры и добавьте среду для посева после нуклеофекции. Перенесите по 500 мкл среды для посева каждого образца в стерильные пробирки объемом 1,5 мл и храните при 37 °C до момента посева.

Для открепления человеческих ПСК с получением суспензии одиночных клеток удалите среду, промойте клетки PBS комнатной температуры и добавьте один миллилитр 0,05% Trypsin или Accutase в культуры чПСК на фидерном слое или без фидерного слоя соответственно. Инкубируйте культуры при 37 °C. Затем осторожно извлеките планшет из инкубатора и, не допуская открепления клеток, аспирируйте агент для диссоциации и добавьте 1 миллилитр среды для человеческих ПСК.

Диссоциируйте отделяющиеся клетки, осторожно промывая поверхность планшета средой, избегая образования пены. Соберите клетки в виде одноклеточной суспензии в чистую стерильную пробирку объемом 15 или 50 мл. Затем используйте 1 мл среды для hESC, чтобы промыть клетки и собрать их в ту же пробирку.

Возьмите аликвоту 50 µL клеточной суспензии для подсчета, а оставшиеся клетки центрифугируйте при 300 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут. Произведите подсчет клеток с помощью прибора для подсчета клеток, пока суспензия центрифугируется. Удалите супернатант и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок в PBS комнатной температуры до концентрации 10⁶ клеток на мл.

Затем перенесите по два миллилитра для каждого экспериментального условия в чистые стерильные пробирки объемом 15 мл и повторите центрифугирование. Пока образцы центрифугируются, приготовьте смеси плазмид в трех чистых пробирках объемом 1,5 мл с молярным соотношением донорской флиппазы 0:1, 2:1 и 2:0, используя 2,5 мкг плазмиды флиппазы. Для проведения нуклеофекции извлеките из инкубатора планшет iDR4 и пробирку объемом 1,5 мл со средой для посева.

Поочередно из каждой пробирки, не затрагивая осадок, осторожно аспирируйте PBS, удаляя как можно больше буфера. Используйте 100 µL раствора для трансфекции, чтобы ресуспендировать осадок путем осторожного пипетирования. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую смеси плазмид, и осторожно перемешайте.

Перенесите смесь ДНК клеток в кювету для трансфекции, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Поместите кювету в прибор для нуклеофекции и запустите программу A13 для клеток, выращенных на фидерном слое, или F16 для трансфекции без использования фидеров. Извлеките кювету и с помощью одноразовых переносящих пипеток из комплекта осторожно, но быстро и одним движением добавьте в кювету 0,5 milliliters среды для посева.

Затем таким же образом восстановите объем и покапельно перенесите его в 12-луночный планшет, содержащий iDR4 и среду для посева. Поместите чашку с культурой на полку в инкубатор и медленно перемещайте ее вперед-назад и из стороны в сторону для равномерного распределения клеточной суспензии. Инкубируйте чашку в течение 24 часов перед заменой среды.

Через два-три дня после трансфекции начните селекцию. Аспирируйте среду, промойте клетки 1 миллилитром PBS, затем добавьте среду для человеческих ЭСК с концентрацией пуромицина 100 нанограмм на миллилитр. Наблюдайте за ростом клеток и соответствующим образом увеличивайте концентрацию пуромицина до максимума 250 нанограмм на миллилитр, продолжая селекцию пуромицином в течение семи дней.

После трех-четырех дней селекции пуромицином начните селекцию с использованием 0,5 micromolar фиалуридина или FIAU. Ежедневно меняйте среду и поддерживайте воздействие FIAU не более семи дней подряд. По завершении селекции, примерно на 14–15 день, появятся резистентные колонии RMCE, которые и составят новую линию RMCE.

Рассейте клетки в соотношении 1:2 согласно стандартным процедурам. Когда лунки из Ключа 1 будут готовы к рассеиванию, диссоциируйте содержимое лунки для характеристики до получения суспензии одиночных клеток, как описано ранее в видео, и соберите клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте клетки при 300 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем используйте 1 mL PBS для ресуспендирования клеток и разделите образец на две части. Одну часть профильтруйте через клеточный фильтр (cell strainer) для проведения проточной цитометрии, а другую используйте для анализа ДНК согласно текстовому протоколу. После трансфекции рекомбиназой flippase и донором tdT RMCE, hPSCs образовали небольшие группы клеток, равномерно распределенные по слою iDR4 MEF, и экспрессировали конститутивный GFP и транзиентный tdT.

Положительный отбор с помощью пуромицина способствует встройке донора RMCE, после чего негативный отбор с использованием FIAU позволяет выделить только те события рекомбинации, опосредованные FRT, в которых отсутствует TK. Примерно на шестой день после трансфекции можно обнаружить небольшие кластеры RMCE GFP-отрицательных, tdT-положительных клеток. Как показано здесь, GFP-отрицательные, tdT-положительные колонии RMCE присутствуют только при использовании как донора RMCE, так и флиппазы, в то время как в отсутствие флиппазы RMCE не происходит. Характеристика с помощью проточной цитометрии недавно созданных линий RMCE (представляющих собой устойчивые к пуромицину и FIAU колонии RMCE, объединенные в неклональную популяцию клеток) подтверждает, что 100% клеток обладают RMCE GFP-отрицательным, tdT-положительным фенотипом.

При использовании доноров RMCE без репортерной активности в hPSC 100% клеток являются GFP-отрицательными. Представленная здесь ПЦР-характеристика неклональной линии RMCE демонстрирует полный обмен кассет и подтверждает, что используемая программа селекции позволяет получать линии без случайных интеграций как донора RMCE, так и вектора, экспрессирующего флиппазу. Резюмируя, данный метод RMCE значительно упрощает редактирование генов в hPSC для определенного локуса по сравнению с использованием таргетных нуклеаз.

После освоения этот метод может быть выполнен за 15 дней. Таким образом, RMCE представляет собой очень быстрый инструмент редактирования генов, который позволяет проводить сравнительные исследования в изогенных условиях. При использовании данной процедуры важно обеспечить эффективность трансфекции выше 30% и провести соответствующий отбор с использованием селективного агента для хранения ядер.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как выполнять RMCE в локусе AAVS1 человеческих ПСК и как характеризовать рекомбинантную линию.