Легким и эффективным подходом к производству Реверсивный дисульфид поперечно-сшитого мицелл
23 декабря 2016 г.
Для доставки лекарств от рака к опухолевым участкам с высокой специфичностью и сниженными побочными эффектами требуются новые методы на основе наночастиц. Здесь мы описываем дисульфидные сшитые мицеллы, которые могут быть легко получены путем окисления, опосредованного перекисью водорода, и способны эффективно диссоциировать в редуцирующей опухолевой среде для высвобождения полезной нагрузки.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обеспечить простой и эффективный протокол синтеза мицелл с дисульфидами, сшитыми лекарственными препаратами, для адресной доставки лекарств. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области наномедицины. Например, как эффективно производить стабильные наносоставы.
Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет легко синтезировать дисульфидные сшитые мицеллы в больших масштабах, что крайне желательно для клинических исследований у пациентов. Чтобы начать эту процедуру, добавьте два грамма монометилированного моноамина полиэтиленгликоля в круглую колбу с дном. Добавьте десять миллилитров безводного ДМФА для его растворения.
Охладите на льду. Добавьте три эквивалента гидроксибензотриазола, три эквивалента ДВС-синдрома и три эквивалента защищенного диэт-моком лизина в колбу с круглым дном. Далее добавьте десять миллилитров безводного ДМФА.
Перемешивайте смесь в течение 20 минут на магнитной пластине для перемешивания. Затем добавьте смесь в круглую донную колбу, содержащую монометил оканчивающийся полиэтиленгликоль. Снимите круглодонную колбу с ледяной бани, затем перемешайте в течение ночи при комнатной температуре.
После завершения перемешивания подтвердите завершение реакции, как указано в текстовом протоколе. Добавьте в реакционную колбу 200 миллилитров ледяного эфира. Центрифугируйте при 6 000 x g в течение шести минут при четырех градусах Цельсия Чтобы отделить осажденный полимер.
Повторите процесс осаждения и центрифугирования дважды, каждый раз растворяя продукт в 10 миллилитрах ДМФА каждый раз перед осаждением. Затем промойте полимер трижды ледяным эфиром. Подключите трубку к источнику высокого вакуума, чтобы удалить остаточный эфир.
После этого добавьте в полимер 20 миллилитров 20%4-метилпиперидина в ДМФА. Перемешивайте до полного растворения. Дайте реакции на веселье в течение трех часов.
После подтверждения завершения реакции просушите полимерное изделие. Теперь полимер промежуточный продукт номер два под вакуумом, затем выполните дополнительные этапы синтеза полимера, как указано в текстовом протоколе. После получения полимерного промежуточного продукта No 10 перенесите его в реакционную колбу.
Добавьте 30 миллилитров безводного ДМФА. В новой колбе растворяют 24 эквивалента активированной холевой кислоты в 20 миллилитрах ДМФА. Затем добавьте 48 эквивалентов N, N-диизопропилэтиламина.
Помешивайте 10 минут. После завершения перемешивания переложите смесь в реакционную колбу, содержащую полимерный промежуточный продукт No 10. Оставьте реакцию на ночь.
На следующий день подтверждают завершение реакции и выпадают в осадок полимерный промежуточный продукт No11, как указано в текстовом протоколе. Затем наберите полимерный промежуточный продукт в деионизированной воде. Лиофилизируйте образец, получив белый порошок.
После приготовления мицеллы растворите 20 миллиграммов телодендримера и пять миллиграммов ПТХ в одном миллилитре хлороформа. Удалите растворитель с помощью ротационного испарителя для получения однородной сухой полимерной пленки. Восстановите пленку с помощью одного миллилитра PBS путем вортексирования.
Затем обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут при частоте 40 килогерц. Добавьте 3% перекись водорода для окисления тиоловых групп на телодендриме. Выполните дополнительные шаги по подготовке и проверке, как указано в текстовом протоколе.
После того, как подготовка мицелл завершена, измерьте размер и распределение мицелл по размерам с помощью прибора динамического рассеяния света. Проводите измерения при комнатной температуре и поддерживайте концентрацию мицелл на уровне одного миллиграмм на миллилитр. Далее приготовьте 7,5 миллиграмм на миллилитр стокового раствора додецилсульфата натрия в PBS.
Затем приготовьте стоковый раствор дисульфидных сшитых мицеллов в PBS в соотношении 1,5 миллиграмм на миллилитр. С помощью этих исходных растворов создают смесь, в которой конечная концентрация SDS составляет 2,5 миллиграмм на миллилитр. А концентрация мицелл составляет 1,0 миллиграмм на миллилитр.
Загрузите образец и измерьте размер и распределение по размерам раствора мицелл с интервалом в две минуты. После сбора свежей цитратной крови у голых мышей центрифугируйте образец крови объемом 1 миллилитр в дозе 1000 x g в течение 10 минут для сбора эритроцитов. Промойте их три раза PBS, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу PBS до конечной концентрации 2%. Смешайте 200 микролитров суспензии эритроцитов с 1,0 мг на миллилитр раствором PTX NCM.
Затем смешайте 200 микролитров суспензии эритроцитов с 1,0 миллиграмм на миллилитр раствором PTX DCM. Инкубируйте эти смеси в шейкере инкубатора в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. После завершения инкубации центрифугируйте смеси при 3000 х г в течение пяти минут.
Перенесите по 100 микролитров надосадочной жидкости каждого образца в 96-луночный планшет. После этого с помощью микропланшетного ридера измерьте абсорбцию свободного гемоглобина на глубине 540 нанометров. Согласно тесту Эллмана, скорость превращения свободных тиоловых групп в дисульфидные связи достигала 85% после 48 часов кислородно-окислительного окисления.
В этом случае в качестве альтернативного метода используется метод окисления, опосредованный перекисью водорода. Коэффициент конверсии достигает 88% за 30 минут. Что в 96 раз быстрее, чем кислородопосредованный подход.
Используя этот более эффективный подход, было получено более 50 граммов наночастиц с измеренным размером частиц 27 нанометров с узким распределением по размерам. Стабильность сшитых мицелл с дисульфидом PTX также исследуется в условиях серьезного разрушения мицелл. Размер частиц мицелл оставался неизменным с течением времени, что указывает на то, что они оставались неповрежденными.
После введения GSH во внутриклеточной концентрации размер нагруженного препаратом дисульфидных сшитых мицелл остается нетронутым в течение 30 минут, затем резко уменьшается до одного нанометра. Это означает уменьшение критического числа дисульфидных связей, что является предпосылкой для быстрой диссоциации мицелл. Здесь представлены репрезентативные результаты гемолитической активности мицелл, нагруженных PTX.
НКМ PTX имеют дозозависимый подсчет лизиса эритроцитов. Однако ДКМП PTX, которые имеют дисульфидное сшивывание, не проявляют наблюдаемой гемолитической активности. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет использовать в другой, если она будет выполнена правильно.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о добавлении равного количества 3% перекиси водорода для образования дисульфида. После этой процедуры может быть проведен анализ гемолиза с целью оценки совместимости в крови дисульфидных сшитых мицелл. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как эффективно синтезировать дисульфидные сшитые мицеллы.
Не забывайте, что некоторые из этих химических веществ могут быть чрезвычайно опасными, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол синтеза нагруженных лекарственным средством мицелл с дисульфидными сшивками, предназначенных для направленной доставки препаратов при терапии рака. Метод основан на использовании окисления под действием перекиси водорода для подготовки мицелл, которые способны диссоциировать в восстановительной среде опухоли для высвобождения терапевтических агентов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Наномедицина
- Терапия рака
- Системы доставки лекарств
Теоретическое введение
- Адресная доставка лекарств имеет решающее значение для минимизации побочных эффектов при лечении рака.
- Наночастицы представляют собой перспективный подход для доставки препаратов непосредственно в очаги опухоли.
- Для повышения стабильности и регулирования высвобождения лекарственных средств могут быть синтезированы мицеллы с дисульфидными сшивками.
- Окисление, опосредованное перекисью водорода, является ключевым этапом процесса синтеза.
Цель исследования
- Разработка простого и эффективного протокола синтеза мицелл, нагруженных лекарственным препаратом.
- Решение проблем, связанных с созданием стабильных наноформуляций для клинического применения.
- Обеспечение возможности крупномасштабного синтеза мицелл для потенциальных исследований с участием пациентов.
Используемые методы
- Приготовление монометил-терминированного полиэтиленгликоль-моноамина в безводном ДМФА.
- Окисление с помощью перекиси водорода для формирования мицелл.
- Характеристика мицелл по показателям стабильности и свойствам высвобождения лекарственного вещества.
- Оценка эффективности мицелл в восстановительной среде.
Основные результаты
- Успешный синтез мицелл с дисульфидными сшивками.
- Мицеллы продемонстрировали эффективную диссоциацию в восстановительных средах.
- Потенциал для направленной доставки противоопухолевых препаратов.
- Масштабируемый метод производства, подходящий для клинических исследований.
Выводы
- Разработанный протокол представляет собой эффективный метод создания мицелл с лекарственным препаратом.
- Мицеллы позволяют повысить специфичность доставки препаратов к опухолям.
- Данный подход может снизить выраженность побочных эффектов, характерных для традиционных методов терапии рака.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол обеспечивает масштабируемое производство мицелл с дисульфидными поперечными сшивками для направленной доставки противоопухолевых препаратов, устраняя одно из основных препятствий на пути внедрения наномедицины в практику. Благодаря использованию окисления с помощью H₂O₂, данный метод позволяет проводить сшивку в 96 раз быстрее, чем при использовании предыдущих подходов, что делает его пригодным для серийного производства в рамках доклинических и клинических исследований. Полученные наночастицы демонстрируют стабильность в системном кровотоке и контролируемое высвобождение в восстановительной микросреде опухоли, что повышает терапевтический индекс и снижает системную токсичность.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет включать цитотоксические агенты, такие как паклитаксел, в состав стабильных наноносителей для изучения механизмов адресной доставки в опухоль.
- Практическая ценность: Обеспечивает быструю разработку различных вариантов формуляций для оценки зависимости «структура — активность» в кинетике высвобождения лекарственного вещества.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Представляет воспроизводимую платформу на основе наночастиц для скрининга профилей высвобождения лекарственных средств в условиях, имитирующих восстановительную среду опухоли.
- Практическая ценность: Обеспечивает узкое распределение частиц по размеру (27 nm), что имеет решающее значение для стабильности результатов анализа и соответствия регуляторным требованиям.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует снижение гемолитической активности по сравнению с несшитыми мицеллами, что улучшает профиль безопасности биосовместимости с кровью.
- Практическая ценность: позволяет производить партии объемом более 50 g, что обеспечивает проведение токсикологических и фармакокинетических исследований для подачи заявки на исследование нового лекарственного препарата (IND).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки наномедицинских препаратов — от первичного скрининга рецептур до доклинической валидации, что позволяет осуществлять итерационный дизайн систем доставки с окислительно-восстановительным откликом.
- Поисковая биология: облегчает проверку гипотезы о том, улучшает ли дисульфидное сшивание накопление препарата в опухоли по сравнению со свободным препаратом.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные мицеллы с высокой эффективностью загрузки препарата для надежной оценки соединений в анализах на цитотоксичность.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных о размере и стабильности с помощью DLS и анализов на гемолиз для сравнения эффективности рецептур.
- Трансляционные исследования: поддерживает преемственность от этапа поиска до доклинических исследований путем подтверждения триггерного высвобождения в восстановительных условиях внутри клеток (индуцированное GSH сжатие размера до 1 nm).
- Корпоративное повторное использование: создает модульную платформу на основе телодендримеров, адаптируемую к различным полезным нагрузкам и таргетным лигандам.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Прогнозируемая уверенность в селективном высвобождении препарата в опухоли посредством валидированной окислительно-восстановительной разборки.
- Операционная ценность: Стандартизированный, масштабируемый синтез с надежным контролем размера частиц и высокой степенью загрузки препарата.
- Стратегическая ценность: Снижение риска неудач на поздних стадиях за счет повышения терапевтического индекса путем минимизации гемолиза и усиления таргетной доставки в опухоль.
- Влияние на портфель: Обеспечение продвижения кандидатов в области наномедицины с учетом рисков посредством масштабируемого производства, совместимого с требованиями GMP.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области химии пептидов, нанопреципитации и обращения с редокс-чувствительными полимерами.
- Для синтеза полимера необходимы безводный DMF, перекись водорода, а также оборудование для диализа и лиофилизации.
- Для обеспечения воспроизводимости партий требуется межкомандная стандартизация подготовки мицелл и контроля качества (DLS, анализ гемолиза).
- Адаптация под альтернативные полезные нагрузки может потребовать оптимизации параметров испарения растворителя и загрузки препарата.
- Практическое ограничение: после окисления необходимо удалить остаточную перекись, чтобы предотвратить деградацию полезной нагрузки или токсичность.
