Простой флуоресценция Анализ на Количественное Собачий Нейтрофильная внеклеточной Trap Release

Общая цель данного эксперимента заключается в выделении покоящихся нейтрофилов и измерении высвобождения ими ДНК в ответ на воздействие агонистов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы иммунологии и ветеринарии, например: какова реакция нейтрофилов на различные агонисты, индуцирующие образование нейтрофильных внеклеточных ловушек или гибель клеток? Основным преимуществом данной методики является возможность экспресс-скрининга различных агонистов и ингибиторов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Начните с введения бабочковой иглы калибра 21G в головную вену здоровой собаки-донора, затем подсоедините шприц объемом 3 мл и возьмите три образца крови по 3 мл, немедленно перенося их в открытые пробирки с ЭДТА. Следите за тем, чтобы венопункция была атравматичной, а кровоток — интенсивным, так как плохой забор крови приведет к низкому выходу нейтрофилов. После заполнения каждой пробирки переверните их несколько раз для обеспечения надлежащего перемешивания крови с антикоагулянтом.

Объедините кровь в конической пробирке объемом 50 мл. Смешайте образцы с равным объемом стерильного 3% Dextran 500 комнатной температуры путем осторожного переворачивания и оставьте пробирку в вертикальном положении на 18–20 минут при комнатной температуре. Затем перенесите соломенно-желтый верхний слой в новую пробирку до тех пор, пока его сбор не станет невозможным без загрязнения нижним красным слоем.

Центрифугируйте верхний слой. Удалите супернатант, вручную ресуспендировав осадок в 10 миллилитрах стерильного PBS комнатной температуры. Затем добавьте 10 миллилитров раствора для разделения клеток на основе полисахарозы и натрия диатризоата комнатной температуры в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Осторожно нанесите слой клеток на раствор для разделения. Разделите клетки путем центрифугирования. Удалите верхние три слоя: плазму, мононуклеарные клетки крови и слой градиента плотности.

Проведите лизис оставшихся эритроцитов, добавив 10 миллилитров воды комнатной температуры. Через 30 секунд добавьте 10 миллилитров стерильного 1.8% раствора sodium chloride комнатной температуры для восстановления тоничности. Перемешайте клетки путем осторожного переворачивания пробирки.

Теперь соберите клетки путем центрифугирования. Осторожно ресуспендируйте белый осадок в 10 миллилитрах стерильного PBS. После подсчета снова центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в стерильном PBS комнатной температуры до концентрации 5 × 10⁶ клеток на миллилитр.

При необходимости высушите на воздухе небольшой объем клеток на предметном стекле, затем проведите окрашивание с помощью набора для быстрой фиксации и окрашивания согласно инструкциям производителя. Если выделение нейтрофилов прошло успешно, то при исследовании под световым микроскопом не менее 95% ядерных клеток должны представлять собой гранулоциты с минимальным загрязнением эритроцитами. Сразу после выделения нейтрофилов пропустите клеточную суспензию через стерильный 70-микронный фильтр и добавьте 5 × 10⁴ клеток в тестовые лунки 96-луночного планшета, содержащего культурную среду, для инкубации в течение 30 минут при 39 °C и 4% CO2.

После прикрепления клеток в тестовые лунки, а также в две контрольные лунки, содержащие только PBS, добавьте интересующий агонист в среде RPMI без фенолового красного с добавлением термоинактивированной FCS до конечного объема 100-200 microliters. Затем добавьте к клеткам соответствующий непроникающий в клетку краситель для нуклеиновых кислот и верните планшет в инкубатор. По истечении необходимого периода инкубации измерьте флуоресценцию на ридере микропланшетов.

Одночасовая стимуляция нейтрофилов собак фактором, активирующим тромбоциты, приводит к среднему четырехкратному увеличению флуоресценции по сравнению с контрольными нестимулированными клетками. Однако PMA является более медленным агонистом, который не вызывает повышения флуоресценции нейтрофилов до двух часов активации, но в конечном итоге приводит к аналогичному кратному увеличению со временем. Флуоресценция красителей нуклеиновых кислот не является специфичной для формирования внеклеточных ловушек нейтрофилов, так как она также возникает при гибели клеток по другим механизмам или при загрязнении реагентов ДНК.

Например, в данном репрезентативном эксперименте коммерческий препарат LPS вызвал очень высокую флуоресценцию в отсутствие нейтрофилов, что, вероятно, было обусловлено загрязнением бактериальной ДНК. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за шесть часов при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного обращения с нейтрофилами.

Не подвергайте клетки вортексированию и удаляйте супернатанты с помощью пипетки, а не сливом. После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как иммунофлуоресцентная микроскопия, чтобы подтвердить, что высвобождение ДНК коррелирует с NET-озом. После разработки этот метод открыл исследователям в области гематологии путь к изучению влияния высвобождаемой ДНК на коагуляцию, а также эффекта новых агонистов NET, включая плазму пациентов.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как выделять нейтрофилы собак и измерять их ответ на воздействие агонистов.