Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований

Общая цель этого протокола заключается в создании белка на основе внеклеточного домена гликопротеина миелина олигодендроцитов или MOG, который может быть использован для индуцирования экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита или EAE. Этот протокол позволяет любой лаборатории производить белок MOG для использования в качестве антигена для индуцирования EAE. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он не полагается на специализированное оборудование для работы с белками, а вместо этого вы можете использовать стандартное оборудование, которое можно найти практически в любой иммунологической лаборатории.

Ну, этот протокол был оптимизирован для белка MOG-метки на основе мышиной версии, он должен работать и для других систем экспрессии белка MOG, которые включают гестат для очистки. Закаляйте пять миллилитров стерилизованного бульона глицериновым бульоном BL 21 MOG tag и инкубируйте его в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин. Добавьте 500 микролитров 100 мг на миллилитр ампициллина в каждую из 500 мл колбы, содержащих 500 мл стерильного LB. Перелейте по одному миллилитру ночной культуры в каждую из двух колб с бульоном LB.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение пяти часов или при оптической плотности до 0,6. Как только желаемая плотность клеток будет достигнута, добавьте 0,5 миллилитра одного молярного IPTG в каждую колбу для культур. Инкубируйте колбу, установите температуру 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение четырех часов, а затем при комнатной температуре и 75 об/мин на ночь.

Равномерно распределите культуры по 250 миллилитровым бутылкам, совместимым с высокоскоростным центрифугированием, и с этого момента держите бутылки на льду. Гранулируйте бактериальные клетки при 22 000 умноженных на г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте и смешайте все бактериальные гранулы в общей сложности 30 миллилитров буфера для лизата.

Перенесите этот объем примерно в нижнюю 50-миллилитровую трубку, способную к высокоскоростному центрированию. Поместите эту трубку на водяную баню с температурой 30 градусов Цельсия на 30 минут. Во время инкубации дважды встряхните трубку, чтобы вернуть клетки на суспендию.

После инкубации перенесите трубку на лед и обрабатывайте раствор ультразвуком с частотой 20 килогерц и амплитудой 70% пульсации в течение трех секунд и выключения в течение трех секунд в течение пяти импульсов, обрабатывайте раствор ультразвуком в течение шести раундов по пять импульсов, позволяя раствору охлаждаться во льду между раундами. Затем центрифугируйте раствор при 24 000 мг в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем повторно суспендируйте гранулу в 30 миллилитрах буфера А и инкубируйте раствор при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. После инкубации обеспечьте раствор ультразвуком на льду, как и раньше, затем добавьте в раствор 17,2 грамма гуанидина HCl.

Инкубируйте образец на льду в течение одного часа, чтобы растворить белок MOG-метки. Чтобы зарядить и уравновесить никелевую смолу, сначала промойте смолу, добавив 40 миллилитров воды в каждую трубку, содержащую смолу. Положите трубки горизонтально на коромысло и дайте им помешать в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия.

По окончании центрифугируйте пробирки при 4500 умноженных на g в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетирования, чтобы не повредить гранулу. Затем добавьте в каждую трубку по 40 миллилитров буфера для заряда.

Переложите трубки на коромысло и дайте им помешать в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия, прежде чем снова центрировать, как и раньше. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в пробирки 40 миллилитров буфера В. Переложите трубки на коромысло и дайте им помешать в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия, прежде чем еще раз центрировать трубки со смолой.

Чтобы очистить белок MOG-метки, перенесите весь объем растворенного белка в первую пробирку, содержащую никелевую смолу. После смешивания поместите трубку горизонтально на коромысло при температуре четыре градуса Цельсия на один час. После центрирования пробирки при 4500 умноженных на g в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия перенесите эту надосадочную жидкость во вторую пробирку с никелевой смолой и инкубируйте, как раньше.

Тем временем повторно суспендируйте никелевую смолу в первой трубке в буфере для эволюции объемом 40 миллилитров и поместите трубку горизонтально на коромысло при температуре четыре градуса Цельсия на пять минут, прежде чем центрировать, как раньше. Перелейте надосадочную жидкость, содержащую упомянутый белок MOG-метки, в бутылку объемом 250 миллилитров с маркировкой очищенный белок, меченный MOG. Держите эту бутылку при температуре четыре градуса по Цельсию.

На каждом этапе элюирования скапливайте полученную надосадочную жидкость в этом флаконе. Добавьте 40 миллилитров полосового буфера к никелю, присутствующему в первой трубке, и поместите горизонтально на коромысло на пять минут при температуре четыре градуса Цельсия. Центрифугируйте пробирку, выбросьте надосадочную жидкость и зарядите никель, поднятый как и раньше.

Закончив, двигайтесь вперед со второй трубкой, как это было сделано для первой трубки. В общей сложности четыре раунда абсорбции растворенного белка на заряженной никелевой смоле и элюирование восстанавливают большую часть белка. Отрежьте примерно 30 сантиметров диализной трубки из змеиной кожи.

Закрепите один конец с помощью фиксирующего гемостата, сложив конец змейкой кожи в три раза и зажав сложенный конец гемостатом. Наполните кожу змеи разведенным белком MOG-метки. Затем удалите все пузырьки воздуха со змеиной кожи, выдавливая их из открытого конца.

Наконец, запечатайте другой конец пробирки с помощью второго стопорного гемостата. Затем наполните большое ведро одним литром одного ацетатного буфера с четырьмя молярами гуанидина. Поместите в ведро до двух секций диализной трубки, содержащей белок MOG-метки.

С помощью скотча закрепите гемостатики сбоку от ведра, чтобы оставить место для беспрепятственного вращения магнитной мешалки на дне. Поставьте ведро в комнату с температурой четыре градуса Цельсия на магнитную юбку и включите его на медленное вращение. Диализ занимает минимум три дня, чтобы постепенно уменьшить количество гуанидина в буфере.

Регулярно проверяйте, чтобы убедиться, что трубка начинается неповрежденной и что концы надежно закрыты. Через четыре-пять часов добавьте один литр одного ацетатного буфера в ведро для диализа. Повторяйте этот процесс каждые четыре-пять часов в общей сложности три раза, чтобы в общей сложности получилось четыре литра воды в ведре.

После того, как вы выбросите половину буфера в ведро, снова наполните его одним литром и установите трубку и перемешайте штангу. Наконец, замените весь четырехлитровый объем в ведре четырьмя литрами свежего ацетатного буфера и дайте помешать в течение четырех-пяти часов. Для достижения наилучших результатов проделывайте этот шаг в день концентрации белка.

Чтобы концентрировать белок MOG-метки, выстелите ручку алюминиевой фольгой и накройте алюминиевую фольгу PEG 3350 и PEG 1000 в соотношении один к одному. PEG 3350 может помочь предотвратить агрегацию белка во время концентрации и является эффективным криоконсервантом. Поместите белок-метку MOG, содержащую трубку из змеиной кожи, поверх алюминиевой фольги и накройте полиэтиленом PEG 8000.

Оставьте его при комнатной температуре и регулярно проверяйте объем, пока объем не станет равным или ниже предполагаемого конечного объема. Если загон перенасыщен водой в процессе концентрации, установите свежую сковороду с алюминиевой фольгой и полиэтиленом. Образцы белка отбираются на протяжении всего протокола очистки или наносятся на страницу SDS для подтверждения чистоты.

На дисплее представлен репрезентативный гель, показывающий высокоочищенную метку MOG с концентрацией 31,86 килодальтон. Чтобы убедиться в правильности сворачивания белка MOG-метки, с помощью проточной цитометрии было оценено связывание белка MOG-метки с CD19-положительными, CD4-отрицательными, девятью В-клетками из лимфатических узлов от диких черных шести мышей типа C57 или мышей IgH MOG, которые экспрессируют тяжелую цепь иммуноглобулина, специфичную к белку MOG. Этот протокол требует минимум 10 дней от начала до конца.

На протяжении всей процедуры выделения важно следить за белком и помнить, что нужно сохранить, а от чего нужно отказаться. Не забывайте, что при использовании гексагидрата сульфата никеля, используемого для зарядки никелевой смолы, чрезвычайно опасен, и следует соблюдать меры предосторожности для предотвращения вдыхания или контакта с кожей или глазами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить и очищать собственный белок MOG-метки.

После очистки белок-метка MOG может быть эмульгирован в полный адъювант Фрейнда и использован в качестве иммунизации для индуцирования EAE. EAE, индуцированная MOG-меткой, может быть использована для изучения участия нескольких типов клеток, таких как CD4 или CDAT-клетки или В-клетки, в аутоиммунных заболеваниях центральной нервной системы. В отличие от короткого пептида, который ограничен МНС, белковый антиген может быть использован в любой линии мышей.