Изучение белка качества системы управления
2 декабря 2016 г.
Социальная амеба Dictyostelium discoideum недавно была создана как система для изучения неправильного сворачивания белка и протеостаза. В этой статье мы описываем новую методологию, основанную на визуализации, для изучения температурно-индуцированной агрегации белков и реакции клеточного стресса у D. discoideum.
Общая цель данного метода визуализации заключается в наблюдении за клеточными нарушениями, индуцированными тепловым стрессом, в клетках Dictyostelium discoideum. Этот метод может помочь в понимании механизмов ответа на тепловой стресс и контроля качества белков у амебы Dictyostelium discoideum. Основным преимуществом данной техники является строгий и точный контроль температуры, поддерживаемой во время визуализации клеток.
Для начала процедуры подготовьте клетки Dictyostelium согласно текстовому протоколу. За день до проведения визуализации пересейте клетки в среду с низкой флуоресценцией (LFM) до концентрации 10 000 клеток на мл. Перед визуализацией соберите клетки с планшета для тканей в среде LFM, затем перенесите необходимое количество клеток в чашки с стеклянным дном.
Дайте клеткам осесть в течение 20 минут, затем осторожно замените отработанную среду на свежую, чтобы удалить неосевшие клетки. Сфотографируйте клетки в условиях отсутствия стресса при 23 °C, захватив минимум шесть полей зрения. Снимите Z-стеки с максимальной высотой 7 µm с шагом от 1 до 0.25 µm, чтобы охватить весь объем клетки.
Затем получите референсное изображение в светлом поле для оценки общего количества клеток. Далее установите температуру охлаждающей камеры на 30 °C. После того как значение на дисплее температуры достигнет заданного уровня, выполните ручную перефокусировку в канале светлого поля.
Перед началом таймлапс-съемки проверьте все записанные поля зрения (FOV), затем запустите таймлапс для четырехчасового теплового стресса с интервалом от 5 до 10 минут между временными точками. Убедитесь в правильности фокусировки во время сбора данных по первым двум временным точкам. После завершения теплового стресса снизьте температуру обратно до 23 градусов Цельсия.
Дождитесь стабилизации показаний температуры на дисплее и выполните ручную перефокусировку. Затем записывайте таймлапс-видео в фазе восстановления в течение 8–10 часов с интервалами от 10 до 20 минут. Убедитесь в правильности фокусировки во время сбора данных в первой временной точке.
Начните с открытия пакета обработки изображений, оснащенного плагином Cell Counter. Загрузите стек изображений в светлом поле, нажав File, затем Open. Далее откройте плагин Cell Counter и загрузите стек изображений, нажав Initialize.
Выберите тип счетчиков, нажав на соответствующий флажок. После этого подсчитайте общее количество клеток и сохраните маркеры, нажав Save Markers. Как только маркеры будут сохранены, загрузите максимальную проекцию гиперстека флуоресцентного изображения.
Откройте плагин Cell Counter и загрузите маркеры, нажав Load Markers. Затем выберите тип маркера для цитозольных фокусов и подсчитайте количество клеток. Существующие маркеры могут служить ориентиром для определения положения отдельных клеток.
Получите количество подсчетов на срез, нажав на «Results», затем сохраните эти данные для последующих расчетов. В данном исследовании наблюдалось распределение меченого GFP полиглутаминового белка Q103 в клетках Dictyostelium. В нормальных условиях роста Q103-GFP диффузно распределен в цитоплазме.
При тепловом стрессе маркер Q103-GFP сливается в пунктирные структуры. После прекращения стресса и культивирования в нормальных условиях роста эти структуры растворяются. Перераспределение Q103-GFP и формирование индуцированных тепловым стрессом цитозольных фокусов количественно определяют с помощью анализа изображений.
Типичные результаты ответа на тепловой стресс представлены здесь. Количество клеток с цитозольными фокусами Q103-GFP увеличивается по мере продолжения теплового стресса. Во время теплового стресса система контроля качества белков перегружается, вследствие чего склонные к агрегации белки не могут поддерживаться в растворимом состоянии.
После теплового стресса количество клеток с цитозольными фокусами уменьшается, что указывает на растворение агрегированных белков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить мониторинг нарушений, вызванных тепловым стрессом, у амебы Dictyostelium discoideum. На протяжении всего процесса визуализации важно помнить о необходимости правильной настройки фокуса, если ваш микроскоп не оснащен функцией аппаратной автофокусировки.
Контроль температуры, продемонстрированный в данном протоколе, может быть использован и за пределами области изучения ответа на тепловой стресс. Визуализация в нормальных условиях роста с использованием контроля температуры может заметно снизить фототоксические эффекты.
Обзор
В данном исследовании представлена новая методика визуализации для изучения индуцированной температурой агрегации белков и клеточных стрессовых ответов у социальной амебы Dictyostelium discoideum. Этот метод позволяет точно контролировать температуру, что дает исследователям возможность наблюдать за влиянием теплового стресса на контроль качества белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Агрегация белков
Теоретические основы
- Dictyostelium discoideum служит модельным организмом для изучения клеточных ответов на стресс.
- Понимание механизмов неправильного сворачивания белков имеет решающее значение для изучения различных заболеваний.
- Тепловой стресс может привести к агрегации белков, что влияет на функции клеток.
- Методы визуализации необходимы для наблюдения за клеточными процессами в режиме реального времени.
Цель исследования
- Разработать метод наблюдения за клеточными нарушениями, вызванными тепловым стрессом.
- Выяснить механизмы ответа на тепловой стресс у D. discoideum.
- Оценить эффективность контроля качества белков в условиях стресса.
Используемые методы
- Подготовка клеток Dictyostelium в среде с низкой флуоресценцией.
- Визуализация при контролируемых температурах (23°C и 30°C).
- Таймлапс-визуализация для мониторинга клеточного ответа в течение нескольких часов.
- Анализ изображений для количественной оценки агрегации и восстановления белков.
Основные результаты
- Белок Q103-GFP демонстрировал диффузное распределение в нормальных условиях.
- При тепловом стрессе Q103-GFP образовывал точечные структуры, что указывало на агрегацию.
- После стресса количество клеток с агрегатами снизилось, что свидетельствует о восстановлении.
- Данный метод успешно продемонстрировал динамику агрегации и растворения белка.
Выводы
- Данный метод визуализации позволяет получить представление о клеточных стрессовых реакциях.
- Контроль температуры имеет решающее значение для точного наблюдения за динамикой белков.
- Данная методология может быть применена в других областях исследований клеточного стресса.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Визуализация живых клеток Dictyostelium discoideum с контролем температуры позволяет точно исследовать механизмы контроля качества белков в условиях стресса, что способствует валидации мишеней на ранних стадиях для путей агрегации белков. Этот подход повышает прогностическую достоверность механистических исследований, имеющих значение для нейродегенерации и протеостаза. Способность данного метода снижать фототоксичность и количественно оценивать динамику агрегации белков предоставляет ценные данные для сортировки портфеля проектов в области биологических исследований.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую наблюдать за динамикой агрегации белков в живой модели, реагирующей на стресс.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков путем количественной оценки клеточных ответов на протеотоксический стресс, вызванный нагреванием.
- Способствует функциональной валидации мишеней системы контроля качества белков, имеющих значение при заболеваниях, сопровождающихся агрегацией.
Скрининг и разработка методов анализа
- Предлагает валидированный протокол визуализации для количественного анализа процессов агрегации и растворения белков.
- Снижает фототоксичность, что позволяет использовать более высокую интенсивность освещения для белков с низким уровнем экспрессии.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты, подходящие для последующих этапов скрининговых исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует механизмам неправильного сворачивания и агрегации белков, имеющим значение при заболеваниях.
- Обеспечивает преемственность между механистическими исследованиями на стадии открытия и разработкой доклинических моделей.
- Поддерживает принятие решений по продвижению терапевтических средств, нацеленных на агрегацию, с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол визуализации интегрирован в цикл исследований: от ранних механизмов до доклинической валидации мишеней агрегации белков.
- Биология открытий: позволяет количественно оценить агрегацию белков, вызванную тепловым стрессом, уточняя пути протеостаза.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели агрегации для разработки анализов.
- Аналитика: предоставляет данные о количестве событий агрегации и динамике восстановления на уровне отдельных клеток.
- Трансляционные исследования: моделирует релевантные для заболеваний стрессовые ответы для сопоставления с биомаркерами.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированный, адаптируемый протокол для различных исследований контроля качества белков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишеней для путей агрегации белков.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет стандартизации визуализации и анализа.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя количественные механистические данные о протеостазе.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию программ, направленных на борьбу с агрегацией, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток и количественного анализа изображений.
- Необходима микроскопия с контролем температуры и совместимое аналитическое программное обеспечение.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров визуализации и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован для других моделей белков, склонных к агрегации, при оптимизации протокола.
- Высокая подвижность клеток и чувствительность к фототоксичности требуют тщательного планирования эксперимента.
