Изучение белка качества системы управления D. discoideum Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый
2 декабря 2016 г.
Социальная амеба Dictyostelium discoideum недавно была создана как система для изучения неправильного сворачивания белка и протеостаза. В этой статье мы описываем новую методологию, основанную на визуализации, для изучения температурно-индуцированной агрегации белков и реакции клеточного стресса у D. discoideum.
Общая цель этого метода визуализации заключается в наблюдении клеточных возмущений, вызванных тепловым стрессом, в клетках Dictyostelium discoideum. Этот метод может помочь понять механизмы реакции на тепловой стресс и контроля качества белка у амебы Dictyostelium discoideum. Основным преимуществом этой методики является жесткий и точный контроль температуры, подаваемой на визуализацию файла клетки.
Чтобы начать процедуру, подготовьте клетки Dictyostelium, как подробно описано в текстовом протоколе. За день до визуализации разделите клетки на среду с низкой флуоресценцией до 10 000 клеток на миллилитр. Перед визуализацией соберите клетки из тканевой пластины в LFM, а затем перенесите достаточное количество клеток в стеклянные донные чашки.
Дайте клеткам отстояться в течение 20 минут, затем осторожно замените использованную среду свежей средой, чтобы удалить неосевшие клетки. Изображение ячеек в ненапряженных условиях при температуре 23 градуса Цельсия приобретает минимум шесть полей зрения. Приобретайте Z-стеки размером не более семи микрометров с шагом от одного до 0,25 микрометра, чтобы захватить весь объем ячейки.
Затем получите эталонное изображение яркого поля, чтобы оценить общее количество ячеек. Далее отрегулируйте температуру охлаждающей камеры до 30 градусов по Цельсию. После того, как отображение температуры достигнет нужного значения, выполните ручную перефокусировку в канале светлого поля.
Проверьте все записанные поля зрения перед началом таймлапса, затем запустите таймлапс для четырех часов теплового стресса с интервалом от пяти до 10 минут между временными точками. Проверьте правильность фокусировки во время съемки первых двух временных точек. После того, как тепловой стресс будет завершен, уменьшите температуру до 23 градусов по Цельсию.
Подождите, пока отображение температуры отрегулируется, и выполните ручную фокусировку. Затем записывайте цейтраферные видеоролики в фазе восстановления в течение 8–10 часов с интервалами от 10 до 20 минут. Проверьте правильность фокусировки во время захвата первой временной точки.
Для начала откройте пакет обработки изображений, оснащенный плагином Cell Counter. Загрузите стек изображений яркого поля, нажав «Файл», затем «Открыть». Далее откройте плагин Cell Counter, загрузите стек изображений, нажав Initialize.
Выберите тип счетчиков, нажав на соответствующее поле. После этого посчитайте общее количество ячеек, сохраните маркеры, нажав Сохранить маркеры. После сохранения маркеров загрузите максимальную проекцию гиперстека флуоресцентного изображения.
Откройте плагин Cell Counter и загрузите маркеры, нажав Load Markers. Далее выберите тип маркера для цитозольных очагов и подсчитайте клетки. Существующие маркеры можно использовать в качестве ориентира для положения отдельных ячеек.
Чтобы получить количество подсчетов на срезе, нажмите «Результаты», затем сохраните подсчеты в другом месте для дальнейших расчетов. В этом исследовании в клетках Dictyostelium наблюдалось распределение GFP-меченого полиглутаминового белка Q103. При нормальных условиях роста Q103-GFP диффузно распределяется в цитоплазме.
Во время теплового напряжения маркер Q103-GFP сливается с точечными структурами. При снятии напряжения и росте при нормальных условиях роста эти структуры растворяются. Перераспределение Q103-GFP и образование цитозольных очагов, вызванных тепловым стрессом, количественно определено с помощью анализа изображений.
Репрезентативные результаты реакции на тепловой стресс можно увидеть здесь. Количество клеток с цитозольными очагами Q103-GFP увеличивается при продолжающемся тепловом стрессе. Во время теплового стресса система контроля качества белка перегружена, поэтому склонные к агрегации белки не могут поддерживаться в растворимом состоянии.
После теплового стресса количество клеток с цитозольными очагами уменьшается, что позволяет предположить, что агрегированные белки растворяются. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как отслеживать возмущения, вызванные тепловым стрессом, у амебы Dictyostelium discoideum. Во время съемки важно помнить о том, что фокус правильно отрегулирован, если ваш микроскоп не оснащен аппаратной автофокусировкой.
Контроль температуры, показанный в этом протоколе, может быть использован за пределами области реакции на тепловой стресс. Визуализация в нормальных условиях роста с использованием контроля температуры может значительно снизить фототоксические эффекты.
Обзор
Это исследование представляет новую методологию визуализации для исследования агрегации белков, вызванной температурой, и клеточных стрессовых реакций в социальной амёбе Dictyostelium discoideum. Техника позволяет точно контролировать температуру, что позволяет исследователям наблюдать эффекты теплового стресса на контроль качества белков.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Агрегация белков
Предпосылки
- Dictyostelium discoideum служит модельным организмом для изучения клеточных реакций на стресс.
- Понимание неправильного складывания белков важно для понимания различных заболеваний.
- Тепловой стресс может привести к агрегации белков, влияя на клеточную функцию.
- Техники визуализации необходимы для наблюдения клеточных процессов в реальном времени.
Цель исследования
- Разработать метод для наблюдения клеточных нарушений, вызванных тепловым стрессом.
- Разъяснить механизмы стрессовой реакции на тепло в D. discoideum.
- Оценить эффективность контроля качества белков в условиях стресса.
Использованные методы
- Подготовка клеток Dictyostelium в среде с низкой флуоресценцией.
- Визуализация при контролируемых температурах (23°C и 30°C).
- Визуализация с интервалом времени для мониторинга клеточных реакций в течение нескольких часов.
- Анализ изображений для количественной оценки агрегации белков и восстановления.
Основные результаты
- Белок Q103-GFP показал диффузное распределение в нормальных условиях.
- Во время теплового стресса Q103-GFP образовывал точечные структуры, указывающие на агрегацию.
- После стресса количество клеток с агрегатами уменьшилось, что указывает на восстановление.
- Метод успешно продемонстрировал динамику агрегации и растворения белков.
Выводы
- Техника визуализации предоставляет представление о клеточных стрессовых реакциях.
- Контроль температуры является критически важным для точного наблюдения за динамикой белков.
- Эта методология может быть применена в других областях исследования клеточного стресса.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
