Определение относительной клеточной поверхности и Total экспрессии рекомбинантных ионных каналов с помощью проточной цитометрии

Общая цель этого метода заключается в количественной оценке экспрессии мембранных белков на клеточной поверхности с помощью флуоресцентного анализа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что проточные цитометрические анализы позволяют получить количественные конечные точки на больших объемах живых клеток за один эксперимент. Применение этого метода распространяется на диагностику и терапию сердечно-желудочковых аритмий, поскольку эти патологии часто связаны с генетическими мутациями, вызывающими дефекты в транспортировке сердечных ионных каналов.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, изо всех сил пытаются определить подходящее место экстрарсального введения эпитопа, которое не вредит их белковой функции и генерирует сильный флуоресцентный сигнал в присутствии конъюгированного антитела. Демонстрировать эту процедуру будет Бенуа Бурден, научный сотрудник моей лаборатории. Для начала, двойная метка ДНК конструируется с mCherry на внутриклеточном С-конце

Кроме того, экспрессируют внеклеточный эпитоп геммагглютинина, который можно измерить с помощью флуоресцентного антитела для оценки экспрессии мембранных белков на клеточной поверхности. Затем культивируйте пластину клеток TSA201 с использованием стандартных методов до тех пор, пока они не достигнут 90% конфлюенции. Для каждого образца готовят реагенты для трансфекции в двух пробирках.

Приготовьте одну пробирку объемом 1,5 мл с четырьмя микрограммами ДНК и 250 микролитрами восстановленной сывороточной среды, а вторую пробирку с 10 микролитрами липосом-опосредованного реагента для трансфекции и 250 микролитрами питательной среды с восстановленной сывороткой. Аккуратно перемешайте две трубки и выдержите их в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем аккуратно соедините содержимое первой и второй пробирок и инкубируйте комплексы липосомной ДНК в течение 20 минут при комнатной температуре.

Добавьте комплексы к культивируемым клеткам и аккуратно покачивайте чашку для культуры. Поставьте тарелку обратно при температуре 37 градусов Цельсия и под атмосферу с содержанием углекислого газа 5% на 24 часа. Через 24 часа после добавления реагента для трансфекции извлеките среду из чашки для культивирования и тщательно промойте клетки 400 микролитрами предварительно подогретого Трипсина-ЭДТА.

Затем добавьте 400 микролитров Trypsin-EDTA и инкубируйте чашку в течение пяти минут, чтобы клетки могли отделиться от чашки. После отделения остановите расщепление фермента, добавив в клетки один миллилитр холодной питательной среды без пенициллина или стрептомицина. Аккуратно нанесите средство на пластину четыре-пять раз, чтобы смыть все клетки с поверхности.

Затем соберите клетки в стерильные пробирки объемом 1,5 миллилитра и сразу же поместите их на лед. Для следующих шагов используйте ледяной раствор и держите клетки при температуре четыре градуса, чтобы предотвратить интернализацию поверхностного эпитопа. Кроме того, уменьшите воздействие света на клетки, чтобы ограничить фотообесцвечивание флуоресцентного сигнала.

Далее центрифугируйте пробирки для гранулирования клеток. Затем тщательно аспирируйте и выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу для приготовления одноклеточной суспензии с использованием одного миллилитра PBS.

Затем кратковременно центрифугируйте пробирки. Гранулируйте и повторно суспендируйте клетки, чтобы полностью удалить питательную среду. Далее повторно суспендируйте клеточную гранулу в 600 микролитрах PBS.

Измерьте концентрацию клеток и отрегулируйте ее как минимум до трех миллионов клеток на миллилитр. Затем разделите клетки на новые пробирки объемом 1,5 миллилитров. Обязательно включите соответствующие контрольные элементы для отличия специфического окрашивания от неспецифического окрашивания, а также для внеклеточного окрашивания, а также для внутриклеточного окрашивания.

Антитело для контроля изотопа поможет оценить уровень фонового окрашивания и должно совпадать с первичным антителом, благоприятным изотопом и флуорофором. Важно использовать контрольное изотопное антитело и флуоресцентное антитело в одной и той же концентрации. Чтобы оценить экспрессию мембранных белков на клеточной поверхности, сначала пометьте только эпитоп ГК, обращенный к клетке, с помощью конъюгированного антитела флуоресцентного света.

Затем добавьте в пробирку конъюгированное с FITC моноклональное антитело против HA в концентрации пять микрограммов на миллилитр. Кратковременно переведите клетки в вихрь, а затем инкубируйте их на платформе-коромысле в темноте. Выньте клетки из темноты и добавьте 900 микролитров PBS.

Затем центрифугируйте пробирку, чтобы гранулировать клетки и аспирировать надосадочную жидкость. Далее промойте клетки, повторно суспензировав гранулу в одном миллилитре PBS и кратковременно просушив клетки. Затем повторите этап центрифуги, чтобы снова гранулировать клетки.

Повторите этот шаг промывки в общей сложности три раза, чтобы удалить все несвязанные антитела. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах PBS и перенесите суспензию одиночных клеток в проточную цитометрическую пробирку объемом пять миллилитров. Держите клетки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока образец не будет выполнен.

Для оценки внутриклеточной экспрессии общего белка далее помечают проникающие клетки. Это достигается с использованием протокола, аналогичного внеклеточному мечению, но с добавлением буфера для пермеабилизации клеток на основе сапонина. Гранулируйте клетки, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах раствора для фиксации проникабилизации непосредственно из приготовленного поголовья.

Инкубируйте клетки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Затем добавьте 100 микролитров свежеприготовленного буфера для промывки пермеабилизации и кратковременно перебейте клетки. Далее гранулируйте клетки и промойте их еще два раза, используя буфер для промывки с помощью пермеабилизации.

Затем добавьте конъюгированное с FITC моноклональное антитело против ГК в концентрации 5 мкг на миллилитр и 100 микролитров буфера для промывки пермеабилизации. На короткое время сделайте вихрь в клетках и инкубируйте клетки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. Далее добавьте 100 микролитров промывочного буфера для пермеабилизации.

Гранулируйте клетки и промойте их три раза в 100 микролитрах того же буфера, как показано ранее. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах PBS и перенесите суспензию одиночных клеток в проточную цитометрическую пробирку объемом пять миллилитров. Пропустите непроницаемые и проникающие клетки через проточный цитометр в один и тот же день.

Для начала запустите программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и импортируйте файлы FCS, созданные во время проточной цитометрии. Нажмите на первый образец и начните процесс стробирования на графике бокового разброса против прямого разброса. Затем нарисуйте вентиль P1 с помощью значка эллипса вокруг живых клеток, чтобы удалить любой мусор, мертвые клетки или агрегаты.

Затем нарисуйте контурный график параметров трубки mCherry в зависимости интенсивности флуоресценции FITC. Установите P2-вентиль вокруг FITC и mCherry положительных клеток, а P3-вентиль — вокруг популяции флуоресцентно-отрицательных клеток. Далее выберите ворота P2 и P3 и нажмите на значок добавления статистики в окне исходного рабочего пространства.

Нажмите на количество, а затем на среднее. Наконец, примените параметры и статистику гейтов ко всем образцам, исследованным цитометром. Этот протокол был использован для характеристики роли N-гликозилирования на общую и поверхностную экспрессию CaV Alpha 2 Delta 1 в клетках TSA201.

Чтобы получить доступ к экспрессии белка на клеточной поверхности, ГК измеряли на непермеабилизированных клетках, у которых сайты N-гликозилирования были нарушены в четырех сайтах, 16 сайтах или без сайта. Уровни FITC были высокими у дикого типа, и клетки с N-гликозилированием были разрушены в четырех местах, но только фоновые уровни были обнаружены в клетках с 16 разрушенными местами. Для проникнутых клеток флуоресценция FITC увеличивалась при всех условиях, что указывает на то, что все трансфицированные, меченные HA, белки CaV Alpha 2 Delta 1 были окрашены и обнаружены антителом против HA FITC.

Кроме того, уровни флуоресценции mCherry были одинаковыми для пермеабилизированных и непермеабилизированных клеток, что указывает на то, что пермеабилизация не изменяет относительный сигнал mCherry. Анализы, проведенные после пермеабилизации клеток, показали, что общая экспрессия белка в клетках с 16 нарушенными локациями также значительно снизилась, независимо от того, было ли это выведено из флуоресценции FITC в пермеабилизированных клетках или из конститутивной флуоресценции mCherry, измеренной в непермеабилизированных и в пермеабилизированных клетках. В дополнение к этой процедуре могут быть выполнены дополнительные физиологические записи для корреляции экспрессии и функции ионных каналов.

Этот метод также открывает путь к исследователям в области медицины для изучения влияния генетических мутаций, посттрансляционных модификаций, микроРНК, малых ГТФаз и роли шаперонов в транспортировке мембранных белков, экспрессируемых в рекомбинантных или нативных клетках. После просмотра этого видео вы должны получить хорошее представление о том, как проводить трансфекцию ДНК в рекомбинантных клетках, окрашивать NTAC и пермеабилизированные клетки, а также проводить анализ данных на образцах. Не забывайте, что работа с живыми клетками требует соблюдения мер предосторожности, таких как работа с геламинальной жидкостью для трансфиксации и ношение перчаток при работе с химическими веществами.