Использование фильтра картриджа для фильтрации проб воды и экстракции ДНК окружающей среды
25 ноября 2016 г.
Мы описываем протокол фильтрации проб воды с помощью фильтрующего картриджа и извлечения ДНК из окружающей среды (eDNA) без необходимости вскрывать корпус для снятия фильтра. Этот протокол разработан для метабаркодирования эДНК рыб, но также применим к эДНК других организмов.
Общая цель данного протокола заключается в фильтрации проб воды с использованием фильтрующего картриджа и экстракции экологической ДНК без необходимости вскрытия корпуса для извлечения фильтра с целью метабаркодинга эДНК различных водных организмов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области экологии, такие как мониторинг биоразнообразия и экология сообществ. Основным преимуществом данной методики является то, что фильтрующие картриджи позволяют обрабатывать большие объемы воды, а фильтрация и экстракция ДНК могут проводиться в стерильных условиях.
Для начала данной процедуры подсоедините трубку для высокого вакуума к входному разъему аспиратора. Другой конец трубки подсоедините к коллектору. Убедитесь, что три красных Т-образных клапана на коллекторе находятся в закрытом положении.
Затем наденьте чистую пару перчаток. Установите разъем Люэра (мама) на верхний конец вакуумного резинового шланга. Затем установите вакуумный соединитель на нижний конец.
Осторожно присоедините разъем Люера («мама») к выпускному порту картриджа фильтра. Затем прикрепите вакуумный соединитель к силиконовой пробке. Налейте один литр отобранной пробы воды в подготовленный пластиковый пакет.
Закрутите винтовую крышку с соединителем Luer-lock типа «папа». Затем осторожно подсоедините входной порт собранного картриджа фильтра к соединителю Luer-lock типа «папа». Убедитесь, что все соединения надежно зафиксированы.
Затем подвесьте пластиковый пакет за два зубца на сетчатой панели. Вставьте силиконовую пробку во входной порт коллектора. После этого включите аспиратор.
Откройте красные Т-образные клапаны для фильтрации. Работайте с манифольдом до полного высыхания фильтрующего картриджа. Затем закройте красные Т-образные клапаны.
Повторите весь этот процесс, чтобы профильтровать необходимый объем воды. После фильтрации всех проб воды осторожно извлеките фильтрующий картридж из пластикового пакета и вакуумного контейнера. Закройте оба конца картриджа соответствующими люэровскими колпачками.
Затем с помощью стойкого к растворителям маркера промаркируйте картридж и люэровский колпачок входного отверстия. Храните при 20 °C до начала экстракции ДНК. Для образцов объемом более четырех литров подготовьте десятилитровую бутыль, как подробно описано в текстовом протоколе.
Добавьте пробу воды, которую необходимо профильтровать. Затем плотно вставьте наконечник дозатора объемом 10 мл в клапан флакона. Плотно вставьте входное отверстие фильтрующего картриджа в наконечник дозатора.
Затем вставьте силиконовую пробку во входной порт коллектора. Включите аспиратор. После этого откройте красные Т-образные клапаны для фильтрации.
Продолжайте вакуумирование через манифольд до полного высыхания фильтрующего картриджа. По завершении фильтрации закройте красные Т-образные клапаны. Осторожно извлеките картридж из пластикового пакета и вакуумного коннектора.
Затем закройте оба конца картриджа соответствующими люэровскими колпачками. Используя стойкий к растворителям маркер, подпишите картридж и входной люэровский колпачок. Храните при 20 °C до начала экстракции ДНК.
Предварительно нагрейте инкубатор до 56 °C. Затем отрежьте откидную крышку от пробирки объемом 2,0 мл и утилизируйте ее. Снимите входной люэровский колпачок с фильтрующего картриджа.
Затем вставьте входной порт в пробирку объемом 2.0 мл. С помощью самоклеящейся пленки герметично запечатайте соединение между картриджем и пробиркой для сбора. После этого поместите собранный узел в адаптер центрифуги для конической пробирки объемом 15 мл.
Центрифугируйте картридж в течение одной минуты при 5000 ×g, чтобы удалить остатки жидкости из фильтра. По завершении центрифугирования извлеките пробирку для сбора из картриджа с фильтром и утилизируйте ее. Затем снова закройте крышкой входной порт.
Затем смешайте 20 µL раствора белка A-Case, 220 µL фосфат-солевого буферного раствора и 200 µL буфера AL. Снимите колпачок с входного отверстия и с помощью пипетки добавьте смесь в картридж, полностью введя кончик пипетки во входной порт. Закройте входной порт колпачком. Затем поместите фильтрующий картридж на роторный шейкер.
Поместите ротационный шейкер в предварительно нагретый инкубатор и установите скорость вращения шейкера на 20 rpm на 20 минут. Во время инкубации промаркируйте новую пробирку объемом 2.0 мл стойким к растворителям маркером. Затем поместите ее в коническую пробирку объемом 50 мл.
По завершении инкубации снимите колпачок впускного отверстия. Затем вставьте впускной порт в новую пробирку объемом 2.0 milliliter. Закройте коническую пробирку завинчивающейся крышкой.
Центрифугируйте в течение одной минуты при 5000 ×g для осаждения экстрагированной ДНК. Затем извлеките картридж из пробирки объемом 2,0 мл с помощью стерильного пинцета. Закройте пробирку крышкой и очистите экстрагированную ДНК согласно текстовому протоколу.
В данной процедуре четыре различных объема морской воды фильтруются на одном коллекторе с использованием двух типов фильтров, после чего проводится экстракция эДНК. С помощью фильтр-картриджей в среднем было обнаружено на 50% больше видов, чем с помощью стекловолоконных фильтров. При должном исполнении и наличии соответствующего опыта выполнение этой методики занимает два часа.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как фильтровать пробы воды с помощью фильтрующего картриджа и как экстрагировать еДНК для метабаркодинга еДНК различных водных организмов, не прибегая к разрезанию корпуса для извлечения фильтра.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод фильтрации проб воды с использованием фильтрующего картриджа для экстракции экологической ДНК (эДНК) без необходимости вскрытия корпуса. Метод в первую очередь предназначен для метабаркодинга эДНК рыб, но может быть применен и для других водных организмов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Анализ экологической ДНК (эДНК)
- Методы метабаркодинга
- Экологический мониторинг
Теоретическая часть
- eDNA позволяет получить данные о биоразнообразии и экологии сообществ.
- Традиционные методы часто требуют инвазивных процедур для извлечения фильтров.
- Данный метод позволяет обрабатывать большие объемы воды.
- Фильтрацию и экстракцию ДНК можно проводить в стерильных условиях.
Цель исследования
- Разработать неинвазивный метод экстракции эДНК.
- Способствовать мониторингу биоразнообразия в водных экосистемах.
- Повысить эффективность метабаркодинга эДНК.
Используемые методы
- Подсоединение трубки для высокого вакуума к аспирационному насосу.
- Подсоединение трубок к коллектору с регулируемыми клапанами.
- Фильтрация проб воды через фильтр-картридж.
- Экстракция эДНК из фильтра без вскрытия корпуса.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно экстрагировать эДНК из больших объемов воды.
- Обеспечивается стерильность в процессе фильтрации и экстракции.
- Метод применим к различным водным организмам, помимо рыб.
- Повышается достоверность исследований по метабаркодингу эДНК.
Выводы
- Этот метод упрощает экстракцию эДНК из проб воды.
- Он способствует экологическим исследованиям, предоставляя надежный инструмент для оценки биоразнообразия.
- В будущем данная методика может быть применена и в других областях экологического мониторинга.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективная экстракция экологической ДНК (эДНК) из водных проб большого объема с использованием фильтрующих картриджей позволяет осуществлять неинвазивный высокопроизводительный мониторинг биоразнообразия в водных системах. Данный подход способствует раннему обнаружению и валидации целей, предоставляя надежные количественные данные о присутствии видов без нарушения среды их обитания. Масштабируемость и стерильность этого метода имеют непосредственное значение для биофармацевтических групп, разрабатывающих или валидирующих экологические биомаркеры и экологические анализы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить проверку гипотез о водном биоразнообразии, используя eDNA в качестве молекулярного индикатора.
- Обеспечивает функциональную валидацию экологических мишеней за счет сбора исчерпывающих данных о видах из больших объемов воды.
- Повышает прогностическую достоверность при разработке экологических биомаркеров благодаря стандартизированному неинвазивному отбору проб.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных образцов эДНК для последующего метабаркодинга и молекулярного анализа.
- Повышение воспроизводимости и стандартизации анализа за счет соблюдения стерильности и минимизации риска контаминации.
- Обеспечение масштабируемого высокопроизводительного скрининга экологических проб для обнаружения и количественного определения видов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров, обеспечивая неинвазивный мониторинг состояния экосистемы.
- Обеспечивает непрерывность процесса от отбора проб из окружающей среды до молекулярного анализа, поддерживая оптимизированное с учетом рисков развитие экологических тестов.
- Снижает механистическую неопределенность в доклинических экологических исследованиях за счет предоставления количественных и воспроизводимых данных едДНК.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол фильтрации и экстракции применяется на стыке отбора проб из окружающей среды и разработки молекулярных анализов, поддерживая рабочие процессы от начального этапа поиска до доклинической валидации.
- Открыточная биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение путей в исследованиях водного биоразнообразия.
- Скрининг: обеспечивает получение образцов эДНК, готовых к анализу и с минимальным уровнем загрязнения, для надежного последующего исследования.
- Аналитика: предоставляет результаты количественного определения видов для сравнительного и статистического анализа.
- Трансляционные исследования: позволяет соотносить данные с биомаркерами здоровья экосистем и стратегиями неинвазивного мониторинга.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает многократно применимый масштабируемый протокол для различных областей применения эДНК в водной среде.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность при валидации экологических мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, стерильность и масштабируемость рабочих процессов анализа еDNA.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о целесообразности дальнейшего проведения работ и экономически эффективной разработке методов анализа.
- Влияние на портфель проектов: позволяет осуществлять приоритизацию программ по изучению экологических биомаркеров и аналитических методов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами стерильного переноса и рабочими процессами в области молекулярной экологии.
- Необходим доступ к оборудованию для вакуумной фильтрации, инкубаторам и центрифугам.
- Требуется межгрупповая стандартизация процессов обработки и маркировки образцов.
- Методика адаптируема к различным водным средам и объемам проб.
- Результат зависит от валидированных протоколов последующей очистки и анализа ДНК.
