Гибрид-Cut: улучшенный Секционирование Метод непокорных растительных образцов тканей

Общая цель метода гибридного разреза ткани заключается в улучшении целостности разрезанных неподатливых растительных тканей с жесткими волокнами и кристаллами кремнезема для создания подходящих образцов тканей для анатомических и биологических исследований. Растения, которые содержат большое количество кристаллов и кремнезема, могут сильно пострадать от разрыва парафина и проблем во время разрезания. Этот метод значительно улучшает целостность тканей.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что секционирование при сверхнизкой температуре в криостате упрочняет парафиновый блок, значительно снижая проблему сдвига кристаллов. Применение этого метода может распространяться, в частности, на гибридизацию in situ, FISH и внутреннюю оценку. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку шаги по обеспечению плотного прилегания парафинового блока к сцене могут оказаться сложными.

Для начала выберите зрелые растения орхидей фаленопсис на стадии пяти листьев. Аккуратно удалите листья, разорвав их вдоль среднего ребра. С помощью острого скальпеля аккуратно удалите пазушные почки у основания третьего или четвертого листа на моноподиальной системе.

Немедленно поместите образцы в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий 15 миллилитров ледяного фиксатора PFA. Подайте вакуум на образцы в фиксаторе при температуре четыре градуса Цельсия на 15-20 минут. Из образцов будут выпускаться мелкие пузырьки.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока большая часть образцов не опустится после сброса вакуума. Наконец, подержите пылесос на ночь и медленно отпустите его на следующий день. Далее погрузите зафиксированные образцы в 15 миллилитров PBS и поместите на лед на 15 минут.

Обезвожьте образцы в 15 миллилитров этанола в серии возрастающих концентраций. 30%50%70%85%95% и, наконец, 100%Инфильтрируйте образцы 15 миллилитров смеси этанола и заменителя ксилола в соотношении два к одному объему при комнатной температуре. Продолжайте инфильтрацию, последовательно помещая образцы по 15 миллилитров каждого из следующих веществ.

Смесь этанола и заменителя ксилола в соотношении один к объему, смесь этанола и заменителя ксилола в соотношении от одного к объему и, наконец, чистый заменитель ксилола. Затем инкубируйте ткани в духовке при температуре 60 градусов Цельсия. Инфильтрируйте образцы 15 миллилитров заменителя ксилола и парафиновой смеси при температуре 60 градусов Цельсия.

Наконец, инфильтрируйте парафин в 15 миллиметрах чистого парафина дважды по 12 часов каждый при температуре 60 градусов Цельсия. Повторите этот шаг на следующий день. Чтобы начать заделку, сначала прогрейте металлические формы до 62 градусов по Цельсию, а затем залейте в основание формы примерно 13 миллилитров расплавленного воска.

С помощью разогретых щипцов перенесите образец ткани в форму и ориентируйте его в нужное положение. Осторожно переместите форму на охлаждающую пластину и дайте ей постоять, пока воск не застынет. Затем с помощью бритвенного лезвия обрежьте блок образца парафина в колонку соответствующего размера с трапециевидной поверхностью наверху.

Добавьте 800 микролитров температурного компаунда для оптической резки, или ОКТ, в центр ступени криостата. Поместите парафиновый блок на сцену и быстро сориентируйте тканевый блок в нужное положение. Перенесите парафиновый блок и ступень в кристатную камеру.

Быстро заморозьте ОКТ при отрицательных 42 градусах Цельсия на 10 минут. Затем охладите адаптер crystat и температуру камеры до минус 20 градусов по Цельсию и минус 16 градусов по Цельсию соответственно. Прикрепите блок и столик к адаптеру crystat

Теперь разрежьте ткани до толщины 10 микрометров. С помощью щипцов подхватите срезы тканей и расположите их так, чтобы они плавали на 800 микролитрах воды, обработанной DEPC, на предметном стекле, покрытом поли-л-лизином. Перенесите слайды на горячую плиту, установленную на 42 градуса Цельсия.

Дайте срезам разровняться и используйте фильтровальную бумагу, чтобы впитать воду с краев. Оставьте образец на горячей пластине при температуре 42 градуса Цельсия на ночь, чтобы ткань могла закрепиться на предметном стекле. Чтобы депарафинизировать образцы, сначала поместите смонтированные салфетки в штатив для окрашивания.

Добавьте в баночку для окрашивания 150 миллилитров ксилола, и погрузите стеллаж с предметными стеклами на пять минут. Затем регидратируйте образцы, поместив их в убывающую концентрацию этанола, по 150 миллилитров каждый на три минуты при комнатной температуре. Наконец, погрузите экземпляры в двойную дистиллированную воду на три минуты.

Окрашивайте образцы, поместив предметные стекла в 150 миллилитров раствора гематоксилина на 1,5 минуты. Промойте в течение нескольких секунд в 150 миллилитрах дважды дистиллированной воды, содержащей одну-две капли соляной кислоты N, а затем кратковременно промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой. Еще раз обезвожьте образцы, используя серию из 150 миллилитров увеличивающейся концентрации этанола в течение трех минут при комнатной температуре.

Погрузите образцы в 150 миллилитров ксилола на пять минут. Наконец, установите образцы, аккуратно добавив 600 микролитров монтажной среды на основе ксилола на каждое предметное стекло, а затем наложите на образец защитное стекло. С помощью этого метода были получены срезы тканей орхидей фаленопсис, в том числе обычно трудно поддающаяся разрезу пазушная почка, которая содержит большое количество кристаллов.

Были сохранены детализированные структуры, позволяющие визуализировать белковые тела. При гибридном срезе также производилось четкое сечение для визуализации верхушечной меристемы побега пророщенного семени. На этих изображениях показана подготовка поперечных срезов листьев растений риса и пшеницы с использованием традиционных методов парафинового и гибридного среза.

Эти культуры обычно содержат большое количество кремнезема, что затрудняет их разделку. Целостность тканей на срезах гибридного разреза была значительно улучшена, а ключевые структуры, часто деформированные или трудно обнаруживаемые в образцах парафина, были полностью сохранены в ткани гибридного разреза. Кроме того, разрывы наблюдались только в образцах, срезанных парафином.

Кроме того, сильная сохранение анатомии делает гибридные ткани пригодными для изучения пространственных паттернов экспрессии генов. Здесь гибридизация in situ с Актином и Циклином В1:1 проводилась на срезанных гибридных срезах вторых и третьих пазушных почек орхидей фаленопсис. Улучшенная анатомическая сохранность позволила обнаружить более высокие уровни экспрессии генов-мишеней в развивающихся меристемных клетках третьих подмышечных почек.

При попытке выполнить эту процедуру важно поддерживать температуру на уровне минус 16 градусов по Цельсию, чтобы парафиновый блок затвердел. Это должно привести к хорошему качеству среза ткани. Идея этого метода пришла нам в голову после того, как нам много раз не удавалось провести успешное секционирование орхидей традиционным методом парафина или криосекции.

После этой процедуры могут быть проведены все эксперименты, такие как гибридизация in situ и FISH, чтобы ответить на дополнительные вопросы, включая исследование пространственной локализации и функции генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять высококачественное срезирование тканей в образце непокорного растения.