Молекулярная диффузия в плазматических мембранах первичных лимфоцитах Измеренные с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии

Общая цель этого протокола заключается в измерении скорости диффузии меченого белка в мембранах первичных иммунных клеток с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Этот метод может помочь определить ключевые вопросы в области иммунологии и клеточной биологии, такие как идентификация естественных клеток-киллеров с более активной динамикой мембранных рецепторов. Основное преимущество этой методики в том, что она используется с живыми клетками, поэтому она точно отражает естественное состояние на том, как движутся молекулы.

Применение этого метода распространяется на иммунотерапию рака, если различные естественные свойства клеток-киллеров, такие как молекулярная диффузия, связаны с их функцией, эффективность которой можно предсказать лучше. Хотя этот метод может дать представление о движении молекул в иммунных клетках, он также может быть применен к другим первичным клеткам и клеточным линиям в любой дисциплине. Откройте программу в экспертном режиме, выбрав опцию «Сканировать новые изображения».

Выберите 40-кратную водную линзу объектива на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. На вкладке Получение нажмите кнопки Конфигурация и Сканирование, чтобы открыть Управление конфигурацией и Управление сканированием. На вкладке ConfoCor нажмите кнопку Измерить, чтобы открыть окно Измерение.

Затем создайте папку для сохранения измерений FCS. Запустите новую базу данных изображений, нажав кнопку Создать на вкладке Файл. Включите галогенную лампу.

С помощью кнопки Лазер включите соответствующие лазеры для возбуждения флуорофоров. Затем укажите настройки для захвата изображения в окне Контроль конфигурации. Это включает в себя возбуждающий лазер, фильтры возбуждения и излучения, световой тракт и используемые детекторы.

Аналогичным образом перейдите в окно «Измерение» и настройте параметры FCS на вкладке «Конфигурация системы». Активируйте каналы обнаружения для записей FCS, переключив Ch 1 для зеленого канала и Ch 2 для красного канала. Пока лазер стабилизируется, что может занять до 30 минут, отрегулируйте отверстие.

Сначала поместите каплю красителя объемом 50 микролитров в одну лунку предметного стекла с восемью камерами, покрытого поли-L-лизином. Соседние скважины используются для проведения измерений в ячейках, так как калибровка зависит от предметного стекла. Нанесите каплю дистиллированной воды на объектив с 40-кратным увеличением воды и установите предметное стекло.

Затем нажмите Vis, чтобы выбрать источник видимого света и сфокусироваться на центральном положении флуорофорной капли. В окне «Измерение» выберите вкладку «Получение» и в разделе «Позиции» переключите текущее положение. Затем вернитесь на вкладку «Конфигурация системы» в том же окне и установите высокую или насыщающую мощность для зеленого лазера.

Чтобы проверить стабильность сигнала, нажмите кнопку «Старт», чтобы открыть новое окно, в котором отображается кривая Time trace и Auto correlation. Убедитесь, что флуоресцентный сигнал является высоким, стабильным, а ось y показывает колебания в килогерцовом диапазоне. Более низкие значения могут быть связаны с неточной фокусировкой или деградацией красителя.

Затем в окне «Измерение» выберите кнопку «O Adjust». Затем выберите правильный канал обнаружения и нажмите Auto Adjust X. Если верхняя граница полученной кривой отсутствует или не отцентрирована, отметьте опцию Coarse и нажмите Auto Adjust X еще раз. После настройки направления X проделайте то же самое для направления Y, нажав кнопку Автонастройка Y. Снимите флажок Coarse и чередуйте настройку X и Y, нажимая Auto Adjust, пока оба не получат четкие максимумы и стабильные значения.

Если клетки помечены двумя разными флуорофорами, добавьте каплю раствора красного флуорофора в соседнюю камеру. Затем откалибруйте второй канал. Установите красный лазер на высокую мощность и повторите процедуру калибровки стабильности.

Далее мы измеряем время прохождения свободно диффундирующих флуорофоров через фокус. И мы используем эту стадию для вычисления площади клеточной мембраны, которая находится в фокусе. Для начала сосредоточьтесь на капельке раствора, тщательно проведя процедуру регулировки.

Затем перейдите на вкладку Acquisition в окне Measurement и установите время сбора данных на 30 секунд с тремя повторами. Установите мощность лазера на уровне, близком к насыщению, и нажмите «Пуск», чтобы выполнить измерение. Запишите количество на молекулу или CPM после завершения измерения.

Затем проводят новые измерения, производя итеративное уменьшение мощности лазера. В этот диапазон мощности включите ожидаемую мощность предстоящих измерений ячейки. Затем убедитесь, что значения CPM линейно масштабируются в зависимости от мощности лазера.

При условии, что остальная часть шкалы линейна, насыщенность при максимальной мощности является приемлемой. При первом использовании нового конъюгированного флуоресцентного антитела выполните измерение FCS свободно диффундирующих антител для количественной оценки ожидаемого CPM. И важно использовать лунки, покрытые ПЭГ поли-L-лизином для свободных антител.

Для этой процедуры смажьте предметное стекло в камере 200 микролитрами поли-L-лизина, привитого к полиэтиленгликолю. Дайте раствору настояться в течение часа при комнатной температуре. Исходный раствор можно хранить в холодильнике до двух недель.

А запас порошка следует хранить в морозильной камере. Позже удалите жидкость и дайте камере высохнуть на воздухе. В микроскопе разбавьте антитело в PBS до 1-10 микрограммов на миллилитр.

Перейдите к измерению времени прохождения свободных антител, как описано в предыдущем разделе для свободных флуорофоров. Чтобы провести измерение в клетке, добавьте 125 микролитров клеток в PBS плюс 1% FCS из суспензии клеток, меченных антителами. И 150 микролитров прозрачного Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 в пустую лунку на предметном стекле с покрытием PLL.

Дайте клеткам инкубироваться в темноте при измеряемой температуре не менее 20 минут, прежде чем продолжить, чтобы клетки могли прикрепиться и сбалансироваться. Начните визуализацию с быстрого сканирования XY, чтобы найти минимально возможную мощность лазера, необходимую для просмотра клеток. Затем центрируйте изображение на круглой ячейке средней яркости, где мембрана четко очерчена.

Крайне важно, чтобы в цитоплазме отсутствовал флуоресцентный сигнал. Увеличивайте масштаб до тех пор, пока ячейка не покроет большую часть изображения. Затем сосредоточьтесь на верхней части клеточной мембраны.

Начните с центра ячейки и двигайтесь вверх, пока в центре изображения не появится небольшая круглая область с равномерной флуоресценцией. Решающее значение имеет тщательное размещение фокуса. Если очаг не находится в мембране, обнаруженная флуоресценция не будет исходить от флуоресцентно меченных мембранных рецепторов.

И поэтому результаты не будут отражать их поведение. Теперь на вкладке «Получение» в окне «Измерение» выберите позицию для измерения FCS, активировав перекрестие. Затем установите количество повторов в диапазоне от шести до 10 и установите Время измерения на 10 секунд на повтор.

Теперь вернитесь на вкладку «Конфигурация системы» в окне «Измерение» и уменьшите мощность лазера для измерений FCS до 1–10 микроватт. Затем нажмите кнопку «Пуск». Если интенсивность кривой падает более чем на 30% в течение первых 10 секунд, это означает, что элемент был слишком сильно обесцвечен, и необходимо измерить другую ячейку при более низкой мощности.

Если сигнал потерялся, отрегулируйте фокус в направлении Z и возобновите измерение. После завершения измерения загляните в окно «Контроль сканирования», чтобы убедиться, что клетка все еще находится в центре, чтобы убедиться, что ее мембрана была измерена. Если ячейка переместилась, отбросьте данные.

Теперь перейдите в окно «Автокорреляция» и вручную удалите отдельные повторы, которые содержат маневры масштабирования, обесцвечивание, большие кластеры или другие артефакты. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Удалить», чтобы удалить артефакты. Выбор реальных артефактов требует практики.

Удаление повторов – это простой процесс, но повторы необходимо правильно оценить, чтобы знать, что следует удалять, а что нет. Затем сохраните итоговый файл в формате FCS. Для дальнейшего анализа сохраняйте только те ячейки, в которых после удаления артефактов осталось не менее четырех повторов.

Типичная кривая автокорреляции мембранных рецепторов гладкая и имеет время прохождения в диапазоне от 10 до 400 миллисекунд. Задайте подходящие области таким образом, чтобы были представлены как начало, так и конец самого крутого наклонного участка, представляющего диффузию. Используя модель свободной диффузии в двух измерениях для подгонки данных, обратите внимание на участок кривой с самым глубоким наклоном.

Небольшие колебания на уровне тау или около одной секунды, наблюдаемые в остаточном остатке, допустимы. Если кривая плохо подходит, но в ячейке нет видимых проблем, таких как перемещение, обесцвечивание или кластеры, то, скорее всего, необходимо изменить начальные значения или верхний и нижний пределы модели. После того как модель хорошо вписывается в кривую корреляции Auto, извлеките значения параметров переменных.

Количество молекул может варьироваться от 0,5 до примерно 200 на квадратный микрон для эндогенно экспрессируемых белков. Убедитесь, что значение CPM при измерении клетки составляет не менее 33% от значения, зарегистрированного от свободно диффундирующих антител. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить скорость диффузии белков с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

После освоения этой техники ее можно выполнить за пять-шесть часов при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно держать клетки на льду примерно за 20 минут до начала измерения. Не измеряйте образцы более двух часов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как скорость диффузии коррелирует с уровнем экспрессии определенного белка. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области молекулярной биологии и иммунологии к изучению динамики белков в живых клетках.