Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и

Общая цель данного исследования заключается в создании системы инфекционного культивирования вируса Зика in vitro на основе клеток млекопитающих для изучения репликации вируса Зика, а также в использовании этой платформы in vitro для разработки лекарственных препаратов. Данный подробный пошаговый протокол создания системы инфекционного клеточного культивирования вируса Зика может помочь в изучении механизмов патогенеза заболеваний, вызванных вирусом Зика, и эволюции вирусной вирулентности. Основным преимуществом данного метода является возможность крупномасштабного получения вируса Зика для разработки лекарств и вакцин.

Начните со сбора клеток Vero при 80% плотности в культуральном флаконе T75, аспирировав среду из флакона и промыв клетки двумя миллилитрами фосфатно-солевого буферного раствора. Добавьте два миллилитра 0,25% трипсина и инкубируйте флакон при 37 °C в течение пяти минут. После инкубации добавьте восемь миллилитров ростовой среды с сывороткой для инактивации трипсина. Затем перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл. Далее возьмите 10 µL клеточной суспензии и смешайте с равным количеством 0,4% трипанового синего. Загрузите подготовленную смесь в камеру для подсчета клеток и определите количество жизнеспособных клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Высейте всего семь миллионов клеток во флакон T160 в объеме 30 мл. На следующий день подготовьте инокулят вируса Зика с соответствующей множественностью заражения в 10 мл безсывороточной культуральной среды на один флакон.

Безопасное обращение с вирусом имеет решающее значение для предотвращения распространения инфекции.

Удалите отработанную среду из колбы T160, затем добавьте полные 10 milliliters свежеприготовленного вирусного инокулята. Инкубируйте инокулированные колбы при 37 °C с 5% CO2 в течение четырех-шести часов. Распределяйте инокулят, осторожно наклоняя колбу в стороны каждый час инкубации. По завершении инкубации замените инокулят на 30 milliliters теплой ростовой среды с добавлением сыворотки. Затем продолжайте культивирование вируса в течение следующих 96 часов. Через четыре дня проверьте прогрессирование инфекции, наблюдая за появлением вирусных бляшек на монослое клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. При необходимости сделайте снимки при 40-кратном и 200-кратном увеличении.

Соберите супернатанты клеточных культур через 96 часов и центрифугируйте их при 300 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C для удаления клеточного дебриса. После центрифугирования осторожно слейте супернатанты, не затрагивая осадок дебриса, и перенесите их в пробирки объемом 15 мл.

Храните супернатанты вирусных культур в нескольких аликвотах при температуре -80 °C.

Для определения титра вируса сначала высейте наивные клетки Vero в 12-луночный планшет из расчета 1 × 10⁵ клеток на лунку в объеме 2 мл. На следующий день приготовьте десятикратные серийные разведения супернатантов вирусной культуры, собранных из колбы T160 с использованием безсывороточной среды.

При подготовке последовательных разведений супернатанта вирусной культуры для определения титра соблюдайте правила техники безопасности при работе с вирусом для предотвращения инфицирования.

Затем удалите отработанную среду из каждой лунки 12-луночного планшета с клетками Vero и добавьте по 400 µL разведенного инокулята на клетки Vero в трех повторах. Инкубируйте инокулированные планшеты в инкубаторе для культур тканей от четырех до шести часов.

По окончании инкубации замените инокулят двумя миллилитрами среды с добавлением сыворотки на каждую лунку. Через 48 часов после инокуляции подсчитайте вирусные фокусы в соответствующих разведениях с помощью фазово-контрастного микроскопа. Рассчитайте вирусный титр в бляшкообразующих единицах на миллилитр.

После инокуляции клеток Vero в 12-луночном планшете вирусом Зика с высоким и низким титром и инкубации в течение 48 и 96 часов оценивают репликацию генома с помощью количественной ПЦР для определения экспрессии генома вируса Зика и с помощью иммуноцитохимического анализа на наличие двухцепочечной РНК.

Для проведения иммуноцитохимического анализа удалите среду из лунок 12-луночного планшета и добавьте в каждую лунку по 1 мл метанола. Фиксируйте клетки при температуре 4 °C в течение 30 минут. Затем трижды промойте фиксированные клетки 1x PBS. Добавьте блокирующий буфер и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Разведите мышечную моноклональную антитела J2 к двухцепочечной РНК в блокирующем буфере в соотношении 1:100, добавьте раствор к клеткам и инкубируйте их в этом растворе в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день разведите козьи вторичные антитела IgG-594 к мышиным антителам в блокирующем буфере в соотношении 1:1 000; после промывки клеток 1x PBS добавьте антитела к клеткам и инкубируйте их в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки клеток 1x PBS окрасьте ядра красителем Hoechst и исследуйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа при 100-кратном увеличении.

Через шесть часов после посева наивных клеток Vero в 12-луночный планшет, как было описано ранее, добавьте интересующие цитокины в указанных концентрациях в двух биологических повторностях. Через 12 часов после обработки проведите заражение вирусом Зика, предусмотрев лунки с отрицательным контролем без заражения. Через четыре часа после заражения замените вирусный инокулят средой с цитокинами, затем инкубируйте клетки при 37 °C в течение дополнительных 44 часов. Через 48 часов после заражения подсчитайте вирусные бляшки с помощью фазово-контрастного микроскопа и сделайте репрезентативные снимки зараженных клеток при 40-кратном увеличении.

На этом графике показано содержание генома вируса Zika, измеренное с помощью RT-qPCR. Праймеры как для пан-генотипа, так и для штамма PRVABC-59 продемонстрировали равную чувствительность и специфичность. Как и ожидалось, праймеры к вирусу гепатита C не привели к амплификации какого-либо продукта.

Здесь показана кинетика роста вируса Zika в указанные моменты времени в клетках, инфицированных низким и высоким титром, по сравнению с неинфицированным ложноконтролем. Результаты иммуноцитохимического анализа показывают, что через 48 часов после инфицирования инфицированные клетки сосредоточены в нескольких кластерах, в то время как через 96 часов после инфицирования инфицировано большинство клеток. На этом графике показана модуляция роста вируса Zika различными цитокинами по сравнению с контролем растворителя.

На этих фазово-контрастных изображениях представлены клетки, инфицированные вирусом Зика, с применением и без применения цитокинов. Вирусные бляшки, образованные инфицированными клетками, видны в виде очагов. Обратите внимание, что в лунках, обработанных интерфероном, вирусные бляшки отсутствуют.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как картирование доменов вируса Зика с высоким разрешением для локализации вирусных белков и изучения репликации в клетках комаров и человека, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, выяснить механизмы патогенеза заболевания и эволюцию вирусной вирулентности. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как создать систему инфекционного культивирования вируса Зика in vitro на основе клеток млекопитающих для изучения репликации вируса Зика, а также о применении платформы in vitro для разработки лекарственных препаратов и вакцин.