Добыча на растительной основе Капсулы для микроинкапсуляцию приложений

Общая цель данной процедуры заключается в создании оптимизированного процесса экстракции капсул экзины спорополленина (SEC) для применения в микроинкапсуляции. Данный метод позволяет быстро обеспечить чистый микрозахват для использования в пищевой промышленности и здравоохранении. Основным преимуществом этой методики является значительное сокращение времени процесса экстракции SEC для получения чистых и неповрежденных капсул.

Хотя данный метод позволяет детально изучить процесс экстракции упрощенным способом SEC и провести обширную пошаговую характеристику, его также можно использовать для фундаментальной оценки микроструктуры и морфологии различных растительных биоматериалов. Как правило, лица, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за традиционного процесса экстракции, который длится от 8 до 10 дней и предполагает использование сильных коррозионных кислот при повышенных температурах. Для начала данной процедуры подготовьте в вытяжном шкафу установку для рефлюкса, состоящую из стеклянного конденсатора, системы циркуляции воды и водяной бани.

Поскольку процесс экстракции SEC предполагает использование высококоррозионных кислот и органического растворителя, процедуру следует проводить с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, таких как защитные очки, лабораторный халат, маска и перчатки, с соблюдением мер предосторожности при работе с опасными веществами. Осторожно взвесьте 100 граммов спор L clavatum, избегая образования пыли и вдали от любых источников возгорания. Затем медленно перенесите споры в однолитную круглодонную колбу из PTFE с магнитным перемешивателем.

Добавьте 500 миллилитров ацетона к спорам и осторожно встряхните колбу до образования гомогенной суспензии. Поместите колбу в водяную баню, установленную на 50 °C и подключенную к обратному холодильнику. Нагревайте суспензию с обратным холодильником в течение шести часов при перемешивании со скоростью 200 RPM.

После охлаждения суспензии при комнатной температуре отфильтруйте ее через фильтровальную бумагу под вакуумом и соберите обезжиренные споры в большие стеклянные чашки Петри. Высушите споры при комнатной температуре, накрыв чашки Петри алюминиевой фольгой с отверстиями для испарения растворителя. После переноса высушенных обезжиренных спор в ПТФЭ-колбу объемом один литр добавьте 500 миллилитров 85% раствора фосфорной кислоты.

Поместите колбу в водяную баню, нагретую до 70 °C, и подсоедините ее к обратнику. Нагревайте суспензию с перемешиванием при температуре кипения в течение 30 часов. После охлаждения суспензии до комнатной температуры разбавьте ее 500 мл теплой деионизированной воды и соберите SEC путем вакуумного фильтрования через фильтровальную бумагу.

После этого перенесите SEC в стеклянный стакан объемом три литра для проведения серии промывок. В вытяжном шкафу добавьте к SEC 800 мл горячей деионизированной воды и осторожно перемешивайте в течение 10 минут. Затем профильтруйте суспензию через фильтровальную бумагу под вакуумом.

Перенесите SEC в чистый трехлитровый стеклянный стакан. Повторив предыдущие этапы пять раз, добавьте к SEC 600 мл горячего ацетона и осторожно перемешивайте в течение 10 минут. Соберите SEC путем вакуумной фильтрации и перенесите их в чистый трехлитровый стеклянный стакан.

После повторения предыдущих этапов с использованием соответствующих растворителей перенесите очищенные SEC в шесть больших стеклянных чашек Петри и высушите их в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 24 часов для полного удаления воды. Затем высушите SEC в вакуумном сушильном шкафу при температуре 60 °C и вакууме 1 мбар в течение 10 часов или до достижения постоянной массы. После этого перенесите высушенные SEC в полипропиленовый флакон для хранения в сушильном шкафу.

Приготовьте 1,2 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) в деионизированной воде и перенесите его в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 150 мг SEC к раствору BSA. Перемешивайте смесь на вортексе в течение 10 минут до получения гомогенного раствора.

Накрыв пробирку фильтровальной бумагой, перенесите ее в колбу лиофилизатора и сушите в течение четырех часов при вакууме 1 мбар. После высушивания SEC, нагруженных BSA, измельчите агломераты с помощью ступки и пестика. Затем перенесите SEC, нагруженные BSA, в пробирку объемом 50 мл и добавьте 2 мл деионизированной воды для удаления остатков BSA.

Соберите SEC путем центрифугирования при 4 704 ×g в течение пяти минут. По окончании удалите супернатант. Повторите промывку деионизированной водой.

После этого накройте фильтровальной бумагой пробирку с SEC, загруженными BSA. Затем перенесите SEC в морозильную камеру на один час. Проведите лиофилизацию SEC в течение 24 часов.

Храните SEC в морозильной камере до проведения дальнейшего анализа. Поместите 5 mg SEC, нагруженных BSA, в полипропиленовую пробирку объемом 2 mL. Добавьте 1,4 mL PBS и перемешайте на вортексе в течение пяти минут.

После этого подвергните суспензию воздействию ультразвукового зонда при амплитуде 40% в течение трех циклов по десять секунд. По завершении профильтруйте раствор через полиэфирсульфоновый фильтр с размером пор 0,45 микрон. Выполнив предыдущие этапы с плацебо-SEC, измерьте абсорбцию SEC, нагруженных BSA, при 280 нанометрах, используя плацебо в качестве холостой пробы.

Наконец, количественно определите количество инкапсулированного BSA, используя стандартную кривую BSA в PBS. Снимки СЭМ демонстрируют целостные споры с уникальной микроструктурой; до начала обработки на поперечном срезе наблюдались органеллы спороплазма микронного размера. После обезжиривания спор и обработки щелочью морфологических и структурных изменений обнаружено не было.

Снимки СЭМ после кислотного гидролиза демонстрируют сохранные SEC, лишенные спороплазматического содержимого. Анализ CHN показал, что в обезжиренных и обработанных щелочью SEC существенного удаления белковых веществ не наблюдается. Основная часть белковых материалов удаляется при кислотном гидролизе.

Анализ DIPA показывает равномерное распределение SEC по размеру после кислотного гидролиза в течение до 30 часов. Структурная целостность SEC снижается при длительном кислотном гидролизе. Данные SEM и DIPA показывают, что после этапа обезжиривания кислотный гидролиз привел к образованию неповрежденных SEC с равномерным распределением по размеру.

Данные КЛСМ указывают на то, что необработанные SEC проявляют автофлуоресценцию из-за компонентов спороплазма внутри полости споры. После обработки только кислодным анализом все содержимое спороплазма удаляется. После инкапсуляции FITC-BSA внутри SEC наблюдается зеленая флуоресценция.

На изображениях СЭМ видны неповрежденные микроребра после загрузки BSA. После загрузки BSA в SEC не наблюдалось существенных изменений диаметра, круглости и удлинения.

После освоения этот упрощенный процесс экстракции методом SEC может быть выполнен за 48 часов при соблюдении всех правил. При применении данной процедуры для различных спор и пыльцы растений важно помнить о необходимости пошаговой оценки структурно-морфологического и элементного анализа для получения неповрежденных и чистых капсул. После выполнения этой процедуры можно провести другие процессы экстракции с использованием щелочных ферментов, чтобы проверить применимость оптимизированного метода для различных капсул растительного происхождения.

После разработки этот метод открыл исследователям в области микроинкапсуляции, доставки лекарств и тканевой инженерии возможность изучать различные растительные SEC в качестве биоматериалов нового поколения. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экстрагировать и характеризовать SEC из спор растений и пыльцевых зерен, а также проводить инкапсуляцию лекарственных средств и биомакромолекул в SEC.