Новый метод для качественного многомасштабном анализа Бактериальный биопленок на нитчатых конидий с помощью конфокальной и электронной микроскопии

Общая цель этого протокола заключается в использовании микроскопии для анализа образования бактериальных биопленок на нитевидных гифах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, например, как на гифах образуется бактериальная биопленка, насколько они специфичны и из чего состоят. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследовать образование бактериальной биопленки на гифах грибов в различных масштабах, от нанометров до сантиметров.

Демонстрацию процедуры проведут Кора Мигель Геннок из моей лаборатории и Кристоф Роуз, инженер по электронной микроскопии из INRA PTEF Platform. Для начала приготовьте целлофановые мембраны того же диаметра, что и чашки Петри, затем поместите их в кипящую ЭДТА на 30 минут. Затем с помощью деионизированной воды промыть листы и дважды автоклавировать их.

Для приготовления грибковых предкультур прививают гриб на агаровую среду, покрытую предварительно обработанной ЭДТА целлофановой мембраной. Инкубируйте культуры при оптимальной температуре, чтобы получить колонии примерно один сантиметр в диаметре. Из предкультуры инокулируют чашку Петри соответствующей агаровой среды, покрытую целлофановой мембраной ЭДТА, с помощью скальпеля аккуратно поцарапывают внешнюю область колонии предкультуры, а затем переносят гифы на агаровую пластину.

Инкубируйте пластины при оптимальной температуре до тех пор, пока колонии не достигнут примерно одного сантиметра в диаметре. Для приготовления бактериальных культур, таких как P.fluorescens BBc6, используйте стерильную петлю для сбора двух-трех отдельных колоний бактерий из агаровой среды и инокулируйте 25 миллилитров LB. Инкубируйте культуру при оптимальной температуре в течение ночи. После выращивания бактерий в течение ночи центрифугируйте культуру при 5000 г в течение трех минут.

А затем суспензировать гранулу в 25 миллилитрах стерильного 0,1 молярного калийфосфатного буфера. После повторения центрифугирования с помощью того же буфера отрегулируйте конечную концентрацию бактерий до 10 до девяти клеток на миллилитр. Наполните шестилуночный микропланшет пятью миллилитрами бактериальной суспензии.

С помощью стерильного бритвенного лезвия разрежьте целлофановую мембрану грибковой культуры на квадраты, с одной колонией на каждой мембране. Затем с помощью щипцов аккуратно удалить из твердой среды целлофановые квадраты, содержащие гифы, и перенести их в отдельные лунки бактериальной суспензии. Осторожно встряхивайте микропластину до тех пор, пока колонии грибков не оторвутся от целлофана.

Затем удалите листы целлофана, оставив в тарелке колонии грибков. Инкубируйте микропланшет с легким перемешиванием при температуре 20 градусов Цельсия в течение некоторого времени в зависимости от используемых штаммов и анализируемой стадии. Для P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor инкубируйте культуры в течение 30 минут, чтобы получить биопленки на ранних стадиях, и до 16 часов для зрелых биопленок.

Чтобы удалить планктонные бактерии и бактерии, электростатически прикрепленные к гифам, промойте грибок, перенеся его на новую шестилуночную микропластину, заполненную крепким солевым раствором. Аккуратно встряхивайте тарелку в течение одной минуты. Перенесите грибок в новую шестилуночную микропланшет, содержащую пять миллилитров стерильного 0,1 молярного калий-фосфатного буфера.

Аккуратно встряхните тарелку в течение двух минут, а затем перенесите гриб в свежий буфер. Сохраняя колонию грибка в буфере, используйте скальпель, чтобы разрезать колонию примерно пополам. Перенесите половину колонии, подлежащей окрашиванию, в чашку Петри, содержащую один миллилитр стерильной воды, с добавлением соответствующего флуоресцентного красителя для визуализации грибковой сети, такой как агглютинин зародышей пшеницы, конъюгированный с Alexa Fluor 633.

Затем инкубируйте образец в темноте. После окрашивания промойте образец, переложив его в крышку чашки Петри, содержащую 10 миллилитров стерильного 0,1 молярного буфера фосфата калия, и осторожно встряхните в течение одной минуты. Наполовину погрузите предметное стекло в крышку чашки Петри и аккуратно расположите срезанную часть, чтобы она плавала над предметным стеклом.

Затем медленно поднимите предметное стекло из буферного раствора, позволяя образцу аккуратно осесть на предметное стекло. Самым деликатным аспектом является позиционирование образца на предметном стекле. Чтобы избежать описания биопленки, образец и предметное стекло должны быть погружены в воду во время позиционирования образца, и образец больше не должен перемещаться перед визуализацией.

Наконец, добавьте к образцу 10 микролитров антивыцветающей монтажной среды и накройте его стеклянной крышкой. Изучите предметные стекла под конфокальным лазерным микроскопом с объективом 10x или 40x. Используйте комбинацию функций сканирования плитки и Z-стека для получения глобальных 3D-изображений колонии гриба и биопленок.

Чтобы провести электронную микроскопию, после промывки гриба в крепком солевом растворе, как и раньше, перенесите гриб в стерильную воду, а не в буфер, чтобы предотвратить образование кристаллов соли на этапе обезвоживания. Перенесите биопленки в держатель для образцов и удалите лишнюю воду. Затем перенесите образцы в камеру сканирующего электронного микроскопа с переменным давлением.

На охлаждающей ступени Пельтье заморозьте образец до отрицательных 50 градусов Цельсия, позволив ему медленно высохнуть прямо в камере SEM с переменным давлением 100 Па в течение 15 часов. Извлеките образец и перенесите его в систему осаждения пленки в высоком вакууме. Затем покройте образец двумя нанометрами платины под плазмой аргона.

Наблюдайте за образцом с покрытием с помощью сканирующего электронного микроскопа, с помощью полевого эмиссионного пистолета с использованием внутрилинзового детектора высокого разрешения и электронного высокого напряжения в один киловольт. Этот мезомасштабный анализ биопленок демонстрирует гетерогенное распределение биопленки P.fluorescens BBc6 зеленым цветом на гифах L.bicolor S238N, показанных красным цветом. Анализ также позволил отследить образование биопленки с течением времени, начиная с ранних стадий, на которых только некоторые бактерии, помеченные GFP, были прикреплены к гифам, показанным красным цветом, до образования толстой, зрелой биопленки.

Как показано здесь, мезомасштабные изображения с высоким разрешением также использовались для проведения микромасштабного анализа для получения архитектуры колоний. Кроме того, в этой проекции с высоким разрешением, 2D максимальной интенсивности 3D конфокального изображения, специфическая маркировка SYPRO Ruby, показанная красным цветом, указывает на наличие белков в матриксе, с мечеными GFP бактериями BBc6 и мечеными FUN-1 грибами темно-зеленым цветом. После обезвоживания и кодирования того же образца были получены дополнительные детали структуры биопленки с помощью СЭМ-визуализации.

Зеленые стрелки указывают на бактериальные клетки в биопленке, а желтые стрелки указывают на гифы грибов. После освоения эту методику можно сделать примерно за два с половиной часа для одного образца, не считая времени инкубации для образования биопленки и культивирования микроорганизмов. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что успех метода в значительной степени зависит от способности получить очень тонкие колонии грибов, состоящие всего из нескольких слоев гиф.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как мутагенез или гибридизация in situ, для ответа на дополнительные вопросы, такие как функциональная или химическая характеристика биопленки, или для изучения многовидовых биопленок. После своего развития этот метод проложил путь исследователям из различных областей, таких как медицина, наука об окружающей среде, пищевая промышленность и так далее, для изучения образования биопленки во время взаимодействия грибковых бактерий. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать и анализировать образование бактериальной биопленки на гифах грибов.