Высокое разрешение оптического Картирование мыши китайско-предсердного узла

Общая цель данного экспериментального протокола заключается в проведении оптического картирования синоатриального узла мыши в интактном сердце с перфузией по Лангендорфу или в изолированном препарате предсердия. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области электро- и патофизиологии синоатриального узла, касающиеся механизмов нарушений работы водителя ритма, синдрома слабости синусного узла и различных заболеваний, сопровождающихся аритмиями предсердий. Основным преимуществом данной методики является возможность исследования множества параметров в интактных тканях с очень высоким пространственным и временным разрешением.

После подтверждения надлежащего уровня анестезии с помощью щипкового теста (нажатие на палец лапы), используйте изогнутые ножницы Mayo длиной 5,5 дюйма и гемостатический зажим Келли длиной 5,5 дюйма, чтобы сделать разрез длиной один сантиметр на передней части грудной клетки. С помощью изогнутого пинцета Iris длиной четыре дюйма быстро захватите легочную ткань и с помощью ножниц Iris длиной четыре трети дюйма вырежьте легкое, тимус и сердце вместе с перикардом. Промойте ткани оксигенированным модифицированным раствором Тайрода при температуре 37 °C.

Затем с помощью изогнутых трехдюймовых ножниц Ванна-Тюбингена и четырехтретьдюймовых пинцетов номер 5 удалите легкие, тимус и жировую ткань из области сердца. Далее, используя изготовленную на заказ канюлю 21G и два изогнутых 4,3-дюймовых пинцета номер 5 B, канюлируйте аорту и одновременно проведите перфузию и суперфузию сердца раствором Тайрода при 37 °C, пропуская раствор через встроенный нейлоновый фильтр с размером пор 11 мкм перед началом перфузии, чтобы предотвратить закупоривание коронарного русла. Затем подключите датчик давления к люэровскому замку на линии перфузии через трехходовой кран для мониторинга давления в аорте, при необходимости регулируя скорость перфузии для поддержания давления в аорте в диапазоне от 60 до 80 мм рт ст.

Для проведения оптического картирования синоатриального узла сердца, перфузируемого по методу Лангендорфа, поместите орган в стеклянную камеру для тканей в горизонтальном положении задней стороной вверх. Используйте булавки диаметром 0,1 мм, чтобы зафиксировать верхушку желудочка к силиконизированному дну камеры, чтобы предотвратить смещение органа под воздействием потока в ходе эксперимента. Введите небольшую силиконовую трубку в левый желудочек через легочную вену, левое предсердие и митральный клапан, затем зафиксируйте трубку к окружающей соединительной ткани шелковой нитью 40. Далее с помощью другой шелковой нити 40 завяжите петли на верхней и нижней полых венах и приколите край правого ушка предсердия к дну камеры.

Растяните и закрепите другой конец шовного материала на дне камеры, а затем поместите изготовленный на заказ стимулирующий электрод на край правого ушка предсердия. Затем установите два монополярных игольчатых электрода для электрокардиографии диаметром 12 миллиметров рядом с основанием правого и левого желудочков, а заземляющий электрод ЭКГ — рядом с верхушкой желудочка. Для окрашивания ткани введите разведенный краситель в встроенный порт перфузионной линии коронарной перфузии для доставки в течение пяти-семи минут.

После 20 минут стабилизации добавьте 0,5 миллилитра блебистатина при 37 °C в перфузат, после чего введите 0,1 миллилитра блебистатина, разведенного в 1 миллилитре раствора Тайрода при 37 °C, в линию коронарной перфузии в течение следующих пяти-семи минут, используя встроенный инъекционный порт Luer lock. Блебистатин следует использовать с осторожностью. Чтобы предотвратить выпадение ингибитора в осадок, сначала растворите блебистатин в среде, разогретой до четких 37 °C, и интенсивно перемешайте смесь.

Для оптического картирования образца сначала закрепите небольшое покровное стекло на поверхности раствора над тканью, чтобы минимизировать артефакты движения, вызванные вибрацией раствора. Затем, используя гибкий бифуркационный световод с возбуждающим светом от галогенной лампы с низким уровнем шума и постоянным током, направьте отфильтрованный луч света на ткань и зарегистрируйте полученный флуоресцентный сигнал. После канюляции сердца, как было продемонстрировано, отсекулируйте желудочки с передней стороны и вскройте правое предсердие через трехстворчатый клапан вдоль оси верхней полой вены и трехстворчатого клапана, после чего сделайте разрез через медиальную ветвь терминального гребня (crista terminalis).

Чтобы вскрыть переднюю свободную стенку предсердия, сделайте разрез от средней линии разреза медиальной ветви до края правого нижнего угла правого ушка предсердия и закрепите распластанную свободную стенку предсердия булавками к дну камеры с силиконовым покрытием. Чтобы вскрыть левое ушко предсердия, рассеките митральный клапан вдоль верхнего угла митрального клапана левого ушка предсердия. Затем закрепите вскрытое левое предсердие булавками аналогично тому, как это было сделано для правого предсердия.

Затем частично удалите ткань желудочков. Оставьте ободок ткани желудочков для фиксации препарата булавками, чтобы предотвратить повреждение предсердий, и закрепите ткань булавками на дне камеры с покрытием из Sylgard. Теперь приподнимите окончательный препарат примерно на 0.5 миллиметров от дна камеры с силиконовым покрытием, чтобы обеспечить суперфузию с эпикардиальной и эндокардиальной поверхностей, и проведите суперфузию образца раствором Тайрода при температуре 37 °C.

Затем установите специально изготовленный стимулирующий электрод из хлорида серебра на край диссекированного правого ушка предсердия. Разместите один однополярный 12-миллиметровый иглоподобный электрод для электрокардиографии рядом с каждым из правого и левого ушек предсердий, а заземляющий электрод для электрокардиографии установите рядом с предсердно-желудочковым соединением. Для окрашивания тканей сердца с помощью пипетки объемом 1 мл медленно нанесите на ткань вольт-чувствительный краситель, разведенный в растворе Тайрода при температуре 37 °C.

Затем иммобилизуйте образец путем прямого нанесения разведенного блеббистатина на ткань с последующим введением еще 0,5 миллилитров блеббистатина через перфузат и проведите оптическое картирование образца, как было продемонстрировано ранее. Этапы окрашивания ткани и ингибирования блеббистатином являются критическими и требуют точного выполнения и соблюдения процедуры окрашивания, чтобы физиологические параметры предсердий, включая частоту сердечных сокращений, локализацию главного водителя ритма и проведение в предсердиях, не были нарушены. Здесь представлена типичная карта контуров активации правого предсердия, реконструированная для спонтанного синусового ритма сердца мыши, перфузируемого по методу Лангендорфа, а также две соответствующие карты контуров правого предсердия, полученные при частоте дискретизации 1 и 0,5 миллисекунды.

Точка ранней активации расположена в межсосудистой области рядом с верхней полой веной, где анатомически определен синоатриальный узел. В данном эксперите после стимуляции правого ушка предсердия в течение как минимум одной минуты с частотой 10–12 Гц электрическую стимуляцию прекращали, и время восстановления синоатриального узла рассчитывали как интервал времени между последним захваченным потенциалом действия и первым спонтанным потенциалом действия. Активация изолированного препарата предсердий при спонтанном синусовом ритме позволяет точно определить локализацию ведущего водителя ритма.

При надлежащем соблюдении процедур хирургического вмешательства и насыщения красителем значимых изменений физиологических характеристик предсердия наблюдаться не должно. Хотя при артериальном окрашивании может потребоваться большее количество красителя, флуоресцентный сигнал в тканях области синоатриального узла при таком методе насыщения кажется более стабильным, а время затухания интенсивности сигнала после коронарного окрашивания почти в два раза превышает время затухания после поверхностного окрашивания. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает 30–40 минут.

При выполнении данной процедуры следует тщательно определить анатомию предсердий перед совершением разреза, чтобы избежать повреждения тканей предсердий и синусового узла. После данной процедуры могут быть проведены другие исследования, такие как традиционная запись потенциалов с помощью стеклянных митральных электродов, для получения дополнительных данных о характеристиках коммутативного трансмембранного потенциала. После разработки эта методика позволила исследователям в области физиологии интеллекта изучать аритмии предсердий, включая дисфункцию синоатриального узла сердца.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как выполнять оптическое картирование высокого разрешения препарата синусового узла мыши.