Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации актинового цитоскелета в адгезивных клетках млекопитающих на ультраструктурном уровне с помощью трехмерного метода микроскопии сверхвысокого разрешения под названием iPALM. Визуализация iPALM обеспечивает субтрендовое нанометровое пространственное разрешение во всех трех измерениях. Это позволяет визуализировать ультраструктуры с помощью флуоресцентных зондов, что обеспечивает высокую специфичность мечения.

Процедура, представленная в этом видео, должна быть быстро адаптируемой и информативной для визуализации других ультраструктурных особенностей в клетках с помощью локализации одной молекулы на основе микроскопии сверхвысокого разрешения. Начните эту процедуру с подготовки клеток на покровных стеклах в шестилуночной пластине. Чтобы собрать образец для визуализации, с помощью тонких щипцов аккуратно снимите защитное стекло образца из буферного отверстия.

Затем быстро и аккуратно постучите по излишкам буфера, коснувшись края покровного стекла сложенной впитывающей бумагой. Положите ячейку защитного стекла стороной вверх на лист чистой бумаги для линз. Промойте образец, поместив на образец от 30 до 50 микролитров буфера для визуализации.

Удалите излишки буфера, наклоняя и постукивая сложенной впитывающей бумагой. Повторив этап промывки несколько раз, налейте на образец от 30 до 50 микролитров буфера для визуализации. Промокните насухо край покровного стекла и нанесите несколько очень маленьких точек быстроотверждающейся эпоксидной смолы на высохший участок.

Медленно опустите еще одно предварительно очищенное покровное стекло под номером 1,5 на центр ячейки, содержащей 22-миллиметровое покровное стекло. Дайте буферу изображения намочить оба защитных стекла под действием капилляров. Мелкие точки быстроотверждаемой эпоксидной смолы должны прилипнуть к обоим защитным стеклам.

Аккуратно надавите на собранный образец с помощью сложенной впитывающей бумаги, чтобы равномерно распределить давление. Используйте достаточное давление, чтобы сделать ячейку образца тонкой и ровной, но не настолько, чтобы раздавить ячейки. Измерьте правильную толщину, наблюдая за рисунком колец Ньютона.

Обязательно выполняйте этот шаг аккуратно, чтобы свести к минимуму количество пузырьков воздуха. При необходимости потренируйтесь с пустыми покровными стеклами несколько раз. Далее запечатайте пробу расплавленным вазелиновым ланолиновым парафином.

Затем промойте запечатанный образец деионизированной водой. Высушите образец сжатым воздухом, чтобы подготовить его к установке на микроскоп. Переместите подпружиненную верхнюю линзу объектива вверх, чтобы можно было снять держатель образца.

Поместите запечатанный образец на держатель образца и закрепите с помощью нескольких небольших редкоземельных магнитов. Нанесите иммерсионное масло с обеих сторон образца изображения. Поместите держатель образца обратно в оптический путь и осторожно опустите верхнюю линзу объектива.

Включите возбуждение лазеров. Также включите камеры EMCCD в режиме передачи кадров. Далее поверните соответствующие фильтры выбросов.

Активируйте механический затвор, чтобы перекрыть путь верхнего луча, и откройте путь нижнего луча. Сфокусируйте нижнюю линзу объектива путем перемещения с небольшим шагом с помощью пьезопривода. Как только реперная точка окажется в фокусе, откройте верхний путь луча, блокируя нижний путь луча, и сфокусируйте верхнюю линзу объектива аналогичным образом.

Следите за шириной реперной точки на дисплее компьютера для оптимальной фокусировки. Для правильного центрирования откройте верхнюю и нижнюю траектории луча. Вручную отрегулируйте верхнюю линзу объектива, пока нижний объектив остается неизменным, с помощью пары тонких установочных винтов, пока реперные изображения не будут перекрываться как можно ближе, в идеале с точностью до одного пикселя.

Затем выполните тонкую настройку таким образом, чтобы реперные изображения перекрывались с точностью до одной десятой пикселя EMCCD. Отрегулируйте двухосевые пьезозеркала заднего вида с помощью управляющего программного обеспечения, удерживая объективы и нижние отражающие зеркала постоянными. Сравнивайте центры реперных точек верхнего и нижнего объективных видов на экране компьютера, чтобы управлять процессом.

Когда лазеры включены, камеры непрерывно транслируются, а верхний и нижний пути луча открыты, держатель образца Z пьезо колеблется с помощью синусоидальной формы волны напряжения, генерируемой управляющим программным обеспечением, для непрерывного колебания по оси Z на магнитуде 400 нанометров. Вручную перемещайте моторизованный светоделитель в сборе вверх или вниз до тех пор, пока интенсивность реперных точек не изменится. Из-за желаемого эффекта интерференции одиночных фотонов это означает близкое совпадение длин оптических путей.

В оптимальных случаях может быть достигнуто соотношение пиков и впадин более 10. Чтобы амплитуда и фаза на каждой поверхности были как можно более равномерными по всему полю, отрегулируйте нижнее зеркало узла светоделителя с небольшими шагами, чтобы точно настроить зазор и углы наклона. Выполните тонкую юстировку светоделителя путем перемещения образца с шагом 8 нанометров по оси Z на 800 нанометров.

Контролируйте реперную интенсивность между камерами от одной до трех. Отрегулируйте высоту, положение и наклон нижнего зеркала в узле светоделителя с небольшими шагами таким образом, чтобы фаза колебаний первой камеры относительно второй камеры была максимальной, в идеале на 120 градусов. После завершения первоначального выравнивания переместите образец в сканирование для получения подходящего поля зрения, содержащего как ячейки для изображения, так и несколько реперных точек поблизости.

Разместите вокруг системы корпус, чтобы блокировать паразитный свет и окружающие возмущения. После того, как область визуализации будет найдена, снова перенесите образец и запишите калибровочную кривую для использования при последующем извлечении координат Z. С помощью команды можно получить калибровочные сканы в сравнении с пьезоположением образца в главном интерфейсе.

После того, как нужная область найдена и получена калибровочная кривая, введите соответствующие имена файлов в программное обеспечение. Откройте верхнюю и нижнюю траектории луча, затем увеличьте мощность возбуждения 642-нанометрового лазера до максимума. Для Alexa Fluor 647 может потребоваться начальный период отключения Fluor-4.

Подвергайте воздействию с постоянным возбуждением 642 нанометра в течение пяти минут или дольше, если это необходимо, до тех пор, пока не будет наблюдаться мигание одной молекулы. Программное обеспечение позволяет автоматически увеличивать фотоактивацию на 405 нанометров в процессе сбора данных. Для четкой видимости нитчатых элементов обычно требуется большое количество кадров для сбора данных.

Когда все будет готово, начните получение наборов необработанных изображений с помощью команды start iPALM acquisition в главном интерфейсе. Во время сбора данных настройте уровень активации фото, регулируя интенсивность лазера 405 нанометров, чтобы при необходимости поддерживать надлежащую плотность мигания. Когда крышка образца собрана правильно, кольца Ньютона можно наблюдать невооруженным глазом при окружающем освещении или стандартном флуоресцентном освещении.

Выделение осевых положений флуоресцентных излучателей требует одновременной многофазной интерференции в визуализации iPALM, которая калибруется по изменениям интенсивности заданного реперного угла в трех EMCCD. Затем интенсивности нормализуются и подгоняются для определения разности фаз. Вот реконструкцию изображения iPALM с каждой координатой локализации, визуализированной 2D гауссовской диаграммой Гаусса, с шириной, соответствующей неопределенности локализации.

Координата Z окрашивается в соответствии с цветовой шкалой. Можно увидеть участки с плотными и редкими нитчатыми образованиями. Здесь представлены реконструированные изображения iPALM актинового цитоскелета клеток HUVEC, меченных фаллоидином Alexa Fluor 647.

Цвет изображения указывает на координаты Z в соответствии с цветовой шкалой. Гистограмма поперечного сечения строится на основе координат локализации XY вдоль длинной оси прямоугольной области. Гауссов аппроксимация показывает полную ширину на половине максимума 43,88 нанометра, связанную с поперечным сечением.

Эта гистограмма имеет Z-позицию координат локализации в прямоугольной области. Гауссов аппроксимация показывает полную ширину при половине максимума 17,50 нанометров. После освоения этой техники ее можно выполнить за 90 минут, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться понимание того, как визуализировать актиновый цитоскелет в ультраструктуре с помощью iPALM с помощью простой подготовки и монтажа, оптического выравнивания, получения исходных данных и последующего анализа для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением. После своего развития этот метод проложил путь для исследований в области клеточной биологии для изучения наноразмерной архитектуры актинового цитоскелета, а также структур клеточной адгезии, таких как фокальные спайки.