подготовки и In Vitro Характеристика дендримером на основе контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы показать получение и характеристику дендримической парамагнитной хелатации, которая может быть использована в качестве контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии, а также продемонстрировать его эффективность в эксперименте по визуализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области контрастных веществ для МРТ, такие как свойства и эффективность дендримерных контрастных веществ. Основным преимуществом данной методики является удобное приготовление эффективного МРТ контрастного вещества с высоким содержанием белка, что обеспечивает его легкую характеризацию.

Этот метод может быть расширен для дальнейших структурных модификаций и функциональной оптимизации дендримовых контрастных веществ для МРТ, что имеет большое значение для потенциальных приложений in vivo. Последствия распространяются на биомедицинские исследования и диагностическую визуализацию, поскольку высокая молекулярная скорость дендримерных контрастных веществ вызывает более длительное время удержания тканей и значительно усиливает сигнал МРТ. Во-первых, растворите один грамм макроциклического предшественника трибутилового эфира DO3A в пяти миллилитрах ДМФА.

Добавьте 0,67 грамма карбоната калия и перемешивайте при комнатной температуре в течение 45 минут. Добавьте 0,87 грамма трет-бутил-2-бромо-4 4-нитрофенилбутатноата порциями в течение часа и продолжайте перемешивать реакционную смесь в течение 18 часов. Затем удалите ДМФУ с помощью вакуумной дистилляции от луковицы к лампе при температуре от 40 до 60 градусов Цельсия.

Очистите остаток с помощью силикагелевой колоночной хроматографии до получения круглого твердого вещества. Растворите один грамм твердого вещества в смеси 10 миллилитров этанола и 150 микролитров семи обычных растворов аммиака в метаноле. Добавьте 150 миллиграммов палладия на активированный уголь и установите бутылочный реактор в гидрогенизаторе.

Встряхните смесь в течение 16 часов при водородной атмосфере 2,5 бар. Налейте суспензию диатомовой земли в этаноле в воронку из спеченного стекла Отфильтруйте реакционную смесь через диатомовую землю, чтобы удалить палладиевый углеродный катализатор. Удалите растворитель из фильтрата на ротационном испарителе.

Растворите полученное твердое вещество в 15 миллилитрах дихлорметана и четырех эквивалентах триэтиламина. К этому добавляем 1,3 эквивалента тиофосгена и размешиваем смесь при комнатной температуре в течение 16 часов. Удалить растворитель из реакционной смеси на ротационном испарителе и очистить остаток с помощью силикагелевой колоночной хроматографии до получения мономера типа DOTA в виде светло-коричневого твердого вещества.

Приготовьте 66,7 мг дендримера G4 PAMAM из 10%-ного раствора в метаноле путем выпаривания растворителя на ротационном испарителе при температуре 40 градусов Цельсия. Растворите дендример в четырех миллилитрах ДМФА. Добавьте в раствор дендримера 0,105 миллилитра триэтиламина и помешивайте в течение 45 минут при температуре 60 градусов Цельсия.

Затем добавьте 354 миллиграмм мономера порциями в течение часа. Продолжайте помешивать при температуре 45 градусов Цельсия в течение 48 часов. Удалите растворитель с помощью вакуумной дистилляции от луковицы к луковице.

Упаковать колонку эксклюзионной хроматографии путем закручивания липофильного геля фильтрующей среды в метанол в течение трех часов при комнатной температуре. Соберите одну миллилилитровую фракцию, используя метанол в качестве элюента. Проанализируйте дроби по TLC.

Удалить растворитель из фракций, содержащих защищаемый дендримовый хелататор, на ротационном испарителе. Получите протонный ЯМР-спектр соединения и интегрируйте ароматическую и алифатическую области. С помощью этих значений определим количество защищенных макроциклов типа DOTA, сопряженных с дендримером G4 PAMAM.

Чтобы снять защиту с продукта, растворите твердое вещество в пяти миллилитрах муравьиной кислоты и перемешивайте смесь при температуре 60 градусов Цельсия в течение 36 часов. Удалите муравьиную кислоту с помощью ротационного испарителя. Сублимационную сушку остатков удаляют из ротационного испарителя для получения дендримирового хелатора.

С помощью протонного ЯМР определить количество макроциклических единиц, связанных с дендримером. Растворите лиофилизированный хелатор в воде. Используйте 0,1 молярного гидроксида натрия для регулировки pH раствора до 7,0.

Добавьте раствор 113 миллиграммов хлорида гадолиния III в одном миллилитре воды по каплям в раствор хелатора в течение четырех часов. Периодически регулируйте pH до 7,0 с 0,05 молярного гидроксида натрия. Перемешайте смесь при комнатной температуре в течение 24 часов.

Затем добавьте 158 миллиграммов ЭДТА порциями в течение четырехчасового периода, корректируя pH обратно до 7,0 по мере необходимости. Помешивайте еще 24 часа при комнатной температуре. Упакуйте колонку эксклюзионной хроматографии с гидрофильной гелевой фильтрующей средой, набухшей в воде.

Сконцентрируйте реакционную смесь, загрузите смесь в колонку и разбавьте деионизированной водой. Очищенный образец центрифугируют в фильтрующем блоке центрифуги мощностью три килодальтоны в течение 30 минут при 1800-кратном избежении. Повторите фильтрацию около пяти раз, чтобы удалить избыток гадолиния и ЭДТА.

Подтвердите отсутствие свободных ионов гадолиния в фильтрате с помощью оранжевого теста на ксиленол. Удалите летучие вещества из отфильтрованного образца и обсушите остатки для получения дендримового контрастного вещества. Приготовьте стоковый раствор DCA в воде с концентрацией от пяти до 10 миллимоляров.

Чтобы определить точную концентрацию DCA, сначала смешайте 360 микролитров исходного раствора с 60 микролитрами стандарта D2O и трет-бутанола. Поместите 400 микролитров образца во внешнюю ЯМР-пробирку. Поместите коаксиальную вставную трубку ЯМР, содержащую трет-бутанол и раствор сравнения воды, в пробирку для образцов.

Получите протонный ЯМР-спектр и измерьте сдвиг частоты между трет-бутаноловыми сигналами эталонного раствора и образца. Рассчитайте концентрацию ДХК по приведенной формуле с поправкой на добавленный в образец трет-бутанол. Таким же образом определяют концентрацию коммерчески доступного раствора GdDOTA.

Поместите растворы DCA и GdDOTA в буфер HEPES и регуляторы воды в два комплекта пластиковых флаконов. Закройте флаконы крышками, следя за тем, чтобы в них не было пузырьков воздуха. В шприц объемом 60 миллилитров горизонтально загрузите образцы DCA с концентрацией 0,01 и 0,02 миллимоля, один из образцов GdDOTA с концентрацией 0,5 и 1,0 миллимоля и два контрольных образца воды.

Повторите эту процедуру, загрузив второй набор образцов во второй шприц объемом 60 миллилитров. Наполните каждый шприц одним миллимолярным раствором GdDOTA и закройте кончики шприцев. Поместите один из шприцев горизонтально в сканер МРТ так, чтобы образцы были вертикальными по отношению к сканеру.

Вставьте шприцы в центр сканера. Выберите анатомическое сканирование, чтобы расположить шприц в изоцентре магнита. Затем нажмите кнопку светофора, чтобы выполнить корректировку первоначальных параметров сканирования и начать сканирование.

Выберите метод съемки с быстрым/медленным углом для выполнения взвешенной визуализации T1 или метод быстрой съемки с улучшением релаксации для выполнения взвешенной визуализации T2. Используйте сканирование локализатора для выбора коронального среза для вертикально выровненных образцов. Оптимизируйте параметры захвата контраста и шума и получите изображение.

Используйте круговой ROI для определения средней амплитуды сигнала и стандартного отклонения для фона и для каждой выборки. Рассчитайте отношение сигнал/шум. ЯМР, МС MALDI-TOF и элементный анализ показали, что в среднем 49 макроциклических единиц были сопряжены с дендримером G4 PAMAM.

Концентрации и время продольной и поперечной релаксации растворов DCA также определяли с помощью ЯМР. Полученные значения релактивности сравнивали с коммерчески доступным и клинически используемым мономером GdDota. Производительность DCA также сравнивалась с мономером GdDota.

Два набора растворов имели схожие концентрации гадолиния, определяемые количеством сопряженных макроциклических звеньев, а два других набора имели схожие молекулярные концентрации. В эксперименте по взвешенной визуализации T1 с аналогичными концентрациями гадолиния отношение сигнал/шум было немного выше для DCA, чем для GdDOTA. Когда растворы имели схожие концентрации по молекулам, отношение сигнал/шум DCA было примерно в три раза выше, чем у GdDOTA.

В эксперименте с Т2-взвешенной визуализацией отношение сигнал/шум DCA было значительно ниже, чем у GdDOTA в обеих парах концентраций, особенно при более высоких концентрациях DCA. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить очищенное и охарактеризованное контрастное вещество на основе дендримеров для МРТ. После этой процедуры можно получить различные типы дендримовых и наноразмерных контрастных веществ для МРТ путем модификации единиц молекулы и удобного анализа.

Освоив эту технику, исследователи в области разработки контрастных агентов для МРТ смогут подготовить ряд специальных зондов для выполнения различных функциональных исследований, имеющих решающее значение для современной молекулярной визуализации.