Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

Общая цель этого эксперимента заключается в быстром, надежном и стабильном определении количества NK-клеток и уровней активации цитотоксических веществ в образце цельной крови человека. Этот метод может помочь ответить на вопросы в иммунологической области, такие как: Каково влияние внешних вмешательств на биологическую активность NK-клеток? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он является быстрым и точным, при этом обеспечивая воспроизводимые результаты в экспериментах.

Чтобы выделить NK-клетки из цельной крови человека, сначала поместите 15 миллилитровых пробирок с маркировкой «Образец цельной крови», «Отрицательная фракция» и «Положительная фракция» в соответствующие места на штативе для пробирок сепаратора клеток. Когда все пробирки будут загружены, вставьте штатив сепаратора в мини-пробоотборник для автоматической маркировки и выберите в меню пункт «Реагент», чтобы выделить положение, где на штативе будет размещен флакон. Выберите «Считывание реагента», чтобы активировать считыватель 2D-кодов, и держите соответствующий флакон с реагентом перед считывателем 2D-кодов под углом от 0,5 до 2,5 см от крышки считывателя кодов.

Поместите пробирку для считывания в соответствующее положение штатива сепаратора. Далее на вкладке Separation выделите нужные позиции. Затем откройте подменю «Маркировка» и выберите программу автоматической маркировки.

Назначьте микрогранулы реагента для разделения клеток на штативы 1, 2, 3 и 4. И выберите программу разделения Posselwb. Выберите программу «Полоскание для стирки».

Введите 1500 микролитров для параметра Sample Volume (Объем выборки) в подменю Volume (Объем) и нажмите клавишу Enter. Затем нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать разделение ячеек. Нажмите кнопку «ОК», чтобы убедиться, что буфер достаточно для обработки всех образцов.

Чтобы подготовить образец для анализа цитотоксичности, сначала пометьте 1,5 миллилитровые пробирки для каждого образца и/или участника, если это необходимо, и поместите желаемое соотношение NK-клеток и меченых DIO клеток K562 в каждую пробирку. Соберите клетки центрифугированием и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу. Затем повторно суспендируйте клеточную смесь в 500 микролитрах неполной среды NK-клеток и пометьте клетки в каждой пробирке 5 микролитрами йодида пропидия.

Соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования и инкубируйте культуру для выбраковки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. В конце инкубации центрифугируют клетки в тех же условиях центрифуги и ресуспендируют гранулу в 25 микролитрах свежей неполной среды для культивирования NK-клеток. Чтобы проанализировать клетки с помощью проточной цитометрии, сначала нажмите кнопку запуска в программном обеспечении проточного цитометра, чтобы промыть систему.

Затем нажмите на кнопку диаграммы рассеяния, чтобы создать четыре диаграммы рассеяния, и загрузите двойную положительную контрольную трубку. Используя контрольный образец с двойным положительным результатом, определите желаемую интенсивность для лазера мощностью 405 милливатт, чтобы детектор не был перегружен, и настройте тепловизор на получение соответствующего количества клеток. Настройка лазера мощностью 405 милливатт на интенсивность, подходящую для обнаружения как DIO, так и PI, потребует опыта работы с обоими красителями и дальностью обнаружения проточного цитометра.

После того, как получение контрольного образца с двойным положительным результатом будет завершено, загрузите контрольный образец только DIO, выберите объектив 40X и выключите лазер мощностью 642 милливатт и канал Brightfield. Разведите соответствующее количество клеток и повторите сбор для образца только йодида пропидия. Когда все контрольные образцы будут запущены, снова включите лазер мощностью 405 милливатт и канал Brightfield и нажмите кнопку Set Intensity.

Затем на вкладке Получение файлов введите пользовательское имя файла и выберите папку для сохранения файлов данных. Далее введите количество ячеек для приобретения. Загрузите первую пробирку с экспериментальным образцом и нажмите кнопку «Получить».

Когда все образцы будут обработаны, откройте программное приложение для анализа проточного цитометра и откройте один экспериментальный файл RIF. На вкладке компенсации выберите Создать новую матрицу. Программное обеспечение предложит выбрать файлы одного цвета и объединить их для создания файла матрицы, который будет выбран для применения компенсации канала.

Используйте функцию «Строительные блоки» для настройки соответствующих точечных графиков. Затем нажмите на функцию статистики, чтобы получить доступ к номерам ячеек в каждом шлюзе. В этом репрезентативном эксперименте образцы крови были взяты в соответствии с указаниями и измерена концентрация NK-клеток на миллилитр цельной крови для каждого бегуна и в среднем для каждого временного момента.

У трех из четырех бегунов наблюдалось аналогичное небольшое увеличение количества NK-клеток после тренировки. Сразу же следует резкое снижение, прежде чем медленно прийти в норму, через 24-48 часов после окончания мероприятия. В среднем количество NK-клеток уменьшалось через 1,5 часа после тренировки, но возвращалось к почти нормальному уровню через 24 часа.

После подсчета количества клеток цитотоксическая активность NK-клеток была немедленно проанализирована, как только что продемонстрировано, со средним снижением цитотоксичности NK-клеток сразу и через 1,5 часа после окончания тренировки, которая значительно увеличилась через 24 часа после тренировки. Цитотоксичность NK оставалась высокой по сравнению с уровнями до тренировки, хотя и незначительно. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за четыре часа при правильном выполнении.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить и охарактеризовать количество NK-клеток и цитотоксическую активность из образцов крови человека воспроизводимым гидропическим способом.