Используя технологию 3D печати для слияния с МРТ гистологии: Протокол для мозга Секционирование

Основная цель данного протокола заключается в точном совмещении объемов изображений магнитно-резонансной томографии с гистологическими срезами путем создания индивидуальных напечатанных на 3D-принтере держателей для мозга и коробок для нарезки. Хотя в данном видео рассматривается ткань мозга мартышки, этот протокол может быть применен к любому мозгу, будь то мозг грызуна, примата или человека. Подготовьте рабочую станцию согласно описанию в протоколе.

Заполните пробирку Фомблином и марлей до отметки 20 миллилитра. Сжимайте марлю, чтобы в процессе удаления пузырьков воздуха. Осторожно просушите мозг от формалина.

Затем вставьте мозг в пробирку передней частью вниз. Аккуратно зафиксируйте мозг в пробирке, обложив его по бокам марлей для стабилизации положения. Заполните оставшееся пространство в пробирке марлей и фомблином.

По ходу выполнения процедуры осторожно удаляйте пузырьки воздуха. Затем плотно закройте колпачок и загерметизируйте пробирку парафином. Отметьте колпачок и линию вдоль межполушарной щели.

Затем оберните пробирку бумажным полотенцем и поместите ее в катушку так, чтобы метка находилась в верхнем центральном положении. Поместите катушку в МРТ-сканер. После сбора и постобработки данных мы получаем Т2-взвешенное изображение, которое можно использовать для создания цифровой модели мозга.

Откройте МРТ в корональной проекции. Затем с помощью инструментов трансформации выполните ресемплирование изображения до изотропных вокселей размером 1 миллиметр. Далее примените нелинейный фильтр шумоподавления.

Выберите таблицу поиска (look up table) в меню отображения. Затем нажмите кнопку двойного порога (dual Threshold). Переместите ползунок на графике так, чтобы охватить весь мозг.

Создайте бинарную маску мозга, используя алгоритм сегментации Threshold using min/max. Введите значение, расположенное в левом нижнем углу графика интенсивности, непосредственно под шкалой, в поле Lower limit. Затем выберите Binary и снимите флажок Inverse threshold.

Выберите морфологический алгоритм Fill holes. Отметьте галочкой Process in 2.5D. Чтобы заполнить промежуток между задним мозгом и корой, выберите line VOI.

Проведите связь между задним мозгом и корой с обеих сторон мозга в наиболее латеральной точке. Продолжайте проводить связи VOI через весь мозг. Преобразуйте VOI в бинарную маску.

Используйте инструмент Image calculator для объединения бинарных масок VOI и мозга, выбрав операцию OR. Выберите опцию Promote destination image type. Затем выберите морфологический алгоритм Fill holes.

Затем выберите Process в 2.5D. Выберите алгоритм Extract surface, затем Mask image, введите имя и выберите тип файла ply. Промежутки в области вырезания, соответствующие расположению плоскости среза, могут быть заданы относительно передней части мозга, задней части мозга или определенной области интереса, например, имеющихся здесь очагов поражения белого вещества.

Используя инструмент box VOI, обведите область мозга прямоугольником. Скопируйте и вставьте этот прямоугольник на такое количество срезов МРТ, которое соответствует предполагаемой толщине зазоров между пластинами. Затем перейдите вперед на количество срезов МРТ, составляющее один раздел, и разместите прямоугольник аналогично предыдущему этапу, чтобы создать еще один зазор между лезвиями.

Повторите этот процесс для всего мозга. Преобразуйте прямоугольные области интереса (VOI) в бинарную маску. Затем извлеките поверхность с помощью функции Extract surface, как это было сделано ранее для мозга.

Выберите бинарную маску зазора между лезвиями. Используйте функцию Image math, чтобы умножить её на 10 000. Затем с помощью Image calculator прибавьте полученную умноженную бинарную маску к передискретизированному изотропному МРТ-изображению.

Теперь, выбрав трипланарный вид, можно увидеть карту лезвий МРТ, показывающую места разреза мозга в трех ортогональных проекциях. В Netfabb Professional выберите «Add part» (Добавить деталь). Затем выберите модели «Blade Gap» и «Brain Model plys».

Выберите модель мозга и перейдите в режим восстановления (repair mode). Используйте кнопку выбора оболочки, чтобы выбрать мозг. Затем переключите выбор на остальные оболочки и удалите их.

Затем примените исправление и удалите старую часть. Выбрав мозг, выберите команду «Переместить» (Move). Нажмите «В начало координат» (to origin) и запишите параметры в поля X, Y и Z.

Они необходимы для поддержания зазора между лезвиями. Нажмите «перевести». Затем закройте окно.

Выберите модель Blade Gap и перенесите ее, используя параметры, зафиксированные на предыдущем этапе. Выберите модель Brain и перейдите в режим восстановления. С помощью кнопки выбора оболочки выделите мозг.

Затем выберите Smooth triangles. Введите четыре в поле Iterations (количество итераций). И установите флажок Prevent volume shrinking.

Выберите Reduce Triangles и введите 200000 в поле Target Triangle Count. Затем выберите Automatic repair и выполните восстановление по умолчанию. Примените изменения.

Затем экспортируйте сглаженную модель мозга в формате STL. Импортируйте сглаженную модель мозга в Meshmixer. Используйте инструменты скульптинга, чтобы сгладить области, отмеченные линиями VOI.

И исправьте любые другие незначительные дефекты модели. Импортируйте сглаженную, отредактированную модель мозга в Netfabb Professional. Затем добавьте деталь brain slicer parts marmoset.

Выберите Shells и преобразуйте их в части (parts). Затем переименуйте каждую часть согласно описанию в протоколе. Используя настройки выбора, описанные в протоколе, перемещайте части перетаскиванием, чтобы расположить мозг в центре бокса.

Нажмите и перетащите детали, чтобы отрегулировать глубину погружения мозга в контейнере. Выберите сглаженную отредактированную модель мозга, затем модель контейнера и выберите булеву операцию. Нажмите на модель мозга, чтобы она окрасилась в красный цвет.

Затем выберите булево вычитание. Примените вычисления. Проверьте наличие выступов, которые могут помешать правильному размещению мозга.

Обратитесь к дополнительному разделу протокола, чтобы ознакомиться с методом их удаления. Выберите модель зазора лезвия и нажмите «переместить». Зафиксируйте данные в позиции Z.

Это будет положение самого заднего зазора между лезвиями. Затем закройте окно. Выберите деталь лезвия из списка деталей томографа мозга и нажмите Move.

Введите значение Z, полученное на предыдущем шаге. Затем введите текущие значения координат X и Y. Выберите абсолютное перемещение (Translation) и выполните перевод.

Нажмите Duplicate. Если толщина срезов одинакова, как показано здесь, введите общий номер лезвия, общее количество и количество по оси Z, а также введите толщину среза в поле Z gap. Затем выберите duplicate.

Выберите деталь лезвия микротома из компонентов томографа для мозга. Повторите те же шаги по перемещению и дублированию, которые выполнялись для детали лезвия. Выделите все лезвия микротома и основной держатель лезвий, затем нажмите на булеву операцию.

Выберите все лезвия микротома, чтобы они окрасились в красный цвет, и нажмите кнопку булевого вычитания. Затем выполните расчеты. Перейдите в режим восстановления и выберите автоматическое восстановление.

Выполните расширенное восстановление (Extended Repair) и примените исправление. Экспортируйте держатель лезвий в формате STL. Выделите все лезвия, основной и вспомогательный боксы, а также сглаженную и отредактированную модель мозга, и нажмите кнопку булевой операции.

Используйте окно выбора деталей (Parts selection), чтобы окрасить все детали, за исключением основного блока, в красный цвет. Затем выберите операцию булевого вычитания (boolean subtraction). Выполните расчеты.

Перейдите в режим восстановления и отметьте галочкой острые края, которые могут повредить мозг. Их можно исправить в режиме восстановления Netfabb или с помощью инструментов скульптинга в Meshmixer.

Затем выберите «Автоматическое восстановление» (Automatic repair). Выполните расширенное восстановление (Extended Repair). После этого примените восстановление.

Экспортируйте модель Brain Box в формате STL. В программе Cura выберите «Загрузить» (Load) и импортируйте Brain Box. Нажмите кнопку «Повернуть» (Rotate).

Затем нажмите и перетащите объект, чтобы положить коробку плоско. Отредактируйте настройки печати в соответствии с протоколом. После этого сохраните траекторию инструмента.

Повторите ту же процедуру для держателя лезвия, а затем продублируйте объект. После этого сохраните траекторию перемещения инструмента. Нанеся тонкий слой клея на платформу принтера, распечатайте корпус для мозга и держатели лезвий на 3D-принтере, используя настройки, описанные в протоколе.

После завершения печати мозг можно подготовить к нарезке. Обустройте рабочее место согласно описанию в протоколе. Осторожно поместите мозг в контейнер и убедитесь, что он надежно зафиксирован.

Поместите лезвия микротома в держателях в соответствующие пазы коробки. В защитных перчатках плотно прижмите держатели лезвий. Оказывая медленное, равномерное давление, произведите срезы мозга.

Извлекайте срезы по одному, начиная с передней части мозга. Несмотря на простоту данного подхода, метод включает множество этапов, а также использование нескольких типов программного обеспечения, поэтому исследователям следует ознакомиться с пользовательскими интерфейсами перед началом процедуры. В данном рабочем процессе обобщен протокол изготовления устройства для нарезки мозга мармозета.

Мозг фиксируют формалином, затем проводят Т2-взвешенную МРТ с разрешением 150 микрон. Изображения обрабатывают и применяют пороговую фильтрацию для создания бинарной маски. После этого поверхность визуализируют в программном обеспечении для 3D-моделирования.

Булево вычитание шаблона слайсера из модели мозга позволяет создать цифровую модель слайсера для мозга. Затем корпус этого слайсера распечатывается на 3D-принтере. После этого мозг плотно фиксируется в корпусе слайсера для проведения разрезов.

После нарезки мозга визуальное сравнение изображений МРТ in vivo и post-mortem, а также фотографий поверхностей срезов выявляет хорошее соответствие ориентации на нескольких срезах. Более детальное сравнение МРТ post-mortem высокого разрешения с гистологическими срезами нескольких фрагментов мозга, окрашенными люксофаст синим (LFB) и гематоксилином-эозином (CV), демонстрирует точное и последовательное соответствие всех структур мозга мармозета. В этой животной модели рассеянного склероза у животных развиваются очаги поражения белого вещества, распространенные по всему мозгу.

С помощью этого метода небольшие очаги поражения, выявленные при МРТ In Vivo, можно отслеживать как на посмертных МРТ-снимках, так и на гистологических срезах. Гистология и посмертная МРТ также позволяют обнаружить очаги, которые иначе остаются незамеченными при МРТ In Vivo. В данном случае МРТ In Vivo не дала убедительных доказательств наличия нормального гиперинтенсивного сигнала, который указывал бы на наличие очагов поражения в любом из зрительных трактов.

Тем не менее, при посмертном МРТ наблюдались гиперинтенсивные сигналы в зрительном тракте. Эти области напрямую соответствовали миелинизированным поражениям, выявленным на гистологическом срезе с окрашиванием LFB CV. Таким образом, в заключение следует отметить, что представленная здесь методика позволяет исследователям точно оценить патологию, лежащую в основе данных МРТ.

Мы считаем этот подход перспективным для идентификации новых биомаркеров заболеваний головного мозга, а также специфических патологических процессов, таких как воспаление и ремиелинизация.