Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Общая цель этой методологии ПЦР-тестирования в реальном времени заключается в обнаружении патогенов на основе ДНК и РНК вместе с высокой пропускной способностью. Нуклеиновая кислота из клинических образцов будет предварительно амплифицирована с помощью общего пула праймеров, загруженного на планшет OpenArray, и проанализирована на наличие патогенов. Этот метод может помочь в продвижении усилий по эпиднадзору за инфекционными заболеваниями в рамках системы «Единство здоровья».

По сравнению с традиционными методами, этот метод позволяет тестировать большее количество образцов для большего числа целей, не конкурируя друг с другом, тем самым повышая эффективность тестирования. В методе используется специальная наноразмерная ПЦР-планшет. Праймеры и зонды печатаются по краям сквозных отверстий, а образцы загружаются с помощью манипулятора для жидкости.

Мы продемонстрируем метод на клинических образцах, тестируемых на панель респираторных патогенов лошадей и собак. Чтобы начать эту процедуру, сконструируйте пластину так, как описано в текстовом протоколе. Используемая здесь пластина сконфигурирована с 18 мишенями в трех экземплярах.

Добавляйте средства в тампоны и промывание трахеи так, чтобы было не менее одного-двух миллилитров жидкости. Закрутите тампон и DMEM энергично в пробирку. Затем с помощью пипетки переложите примерно 1 миллилитр среды в новую пробирку.

Добавьте 235 микролитров буфера для лизиса и 175 микролитров образца в каждую пробирку. Следуйте протоколу производителя для извлечения общей нуклеиновой кислоты. Подготовьтесь к обратной транскрипции и предварительной амплификации нуклеиновой кислоты или предамплификации, как описано в текстовом протоколе, предварительно проверив карту образца.

Добавьте 8,5 микролитров мастер-микса предусилителя и 5,5 микролитров образца ДНК/РНК в каждую лунку стандартного 96-луночного планшета, используя только левую сторону планшета. После объединения образцов, положительных и отрицательных контролей со смесью предусилителя, тщательно загерметизируйте стандартный 96-луночный планшет прозрачным клеевым уплотнением. Удалите излишки уплотнения с помощью бритвенного лезвия, чтобы предотвратить образование зазоров во время езды на велосипеде.

Центрифугируйте герметичную пластину в течение 20 секунд с помощью спиннера для ПЦР-планшетов. Убедитесь, что все реагенты объединены в нижней части лунок планшета. После включения обычного термоамплификатора выберите программу включения предусилителя и запустите программу.

Помещайте 96-луночный планшет в амплификатор только тогда, когда нижняя часть амплификатора достигнет температуры, необходимой для производства кДНК, контролируя показания температуры на экране. После завершения работы предусилителя убедитесь, что пластина осталась герметичной. Надев двойные перчатки и чехлы на рукава, снимите уплотнитель с пластины предусилителя.

Затем осторожно снимите и выбросьте верхние перчатки. Разбавьте продукты предусилителя от одного до пяти, добавив 56 микролитров TE-буфера в каждую лунку колонок с первой по шестую 96-луночной пластины предусилителя и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз. Для этого нужно идти только до первого упора пипетки, отсасывать снизу и дозировать выше, но не создавать пузырьков.

Добавьте буфер TE ко всем шести столбцам, независимо от неиспользуемых скважин. Подготовьтесь к переносу 384 лунок на амплификационную пластину, как описано в текстовом протоколе. По завершении подготовительных этапов наденьте новые хорошо сидящие двойные перчатки и чехлы на рукава.

Из-за высокой скорости испарения при пипетировании небольших объемов крайне важно эффективно дозировать основную смесь и пробу, а также немедленно запечатать планшет. Добавьте 2,5 микролитра мастер-смеси для амплификации в 384-луночный планшет. Белые таблички используются здесь в демонстрационных целях, а вот черные пластины следует использовать для снижения нагрузки на глаза.

Перенесите 2,5 микролитра разбавленного продукта предусилителя на 384-луночный планшет в соответствии с картой в текстовом протоколе. Показанные здесь цветные кубики иллюстрируют последовательность переноса для пипетки с фиксированным каналом. Сразу же плотно накройте пластину пломбой из фольги.

Выбросьте верхние перчатки и чехлы на рукава. Центрифугируйте 384-луночный планшет в течение 20 секунд в спиннере для ПЦР-планшетов. Не снимайте пломбу из фольги, а поместите пластину 384-луночного сечения в манипулятор для жидкостей.

Откройте упаковку с усиленной пластиной в корпусе и осторожно поместите ее в обработчик жидкости в первый слот с серийным номером справа, держите корпус за края, не касаясь поверхности пластины. Снимите уплотнение из фольги с пластины на 384 лунки внутри обработчика жидкости, как только все будет на месте. Нажмите «Далее», а затем отметьте все флажки по мере выполнения каждого шага.

Закройте дверцу для обработчика жидкостей и немедленно начните процесс наполнения. Оставайтесь рядом с обработчиком жидкостей и сразу же переходите к следующему шагу, как только пластина будет заполнена. Во время работы манипулятора с жидкостями снимите защитную пленку с нижней части крышки кейса.

Оставьте верхнюю пленку на месте. Подготовьте красную ленту, слегка потянув, чтобы освободить ее от клея. Снимите загруженную усилительную пластину с манипулятора жидкости и аккуратно поместите ее в пресс с серийным номером справа.

Положите крышку сверху на тарелку с зазубренным концом справа и клеем на дно. Потяните вниз за рычаг нажатия на пластину, осторожно закрыв ее, индикатор будет мигать в течение 20 секунд. Не прикасайтесь к плитному прессу в течение этого времени.

Как только индикатор загорится зеленым цветом, поднимите рычаг вверх и осторожно снимите герметичную пластину, удерживая ее за края. Удерживая герметичную усилительную пластину вертикально за края футляра, немедленно вставьте наконечник шприца в загрузочное отверстие в конце футляра, затем медленно дозируйте иммерсионную жидкость одним плавным движением, чтобы заполнить пространство между пластиной и крышкой. После погружения тарелки оставьте один небольшой пузырь воздуха в углу.

Продолжая удерживать пластину вертикально за края, загерметизируйте загрузочное отверстие, вставив вилку в отверстие и, повернув вилку по часовой стрелке, приложите достаточное давление, пока ручка не сломается. Очистите корпус безворсовой салфеткой, тщательно сбрызнутой этанолом. Чтобы высушить корпус, протрите его сверху вниз чистой салфеткой.

Поднесите запечатанную пластину к усилительной машине. На вкладке приборов выберите консоль приборов. Выберите усилительную машину и нажмите на кнопку открытой двери.

Поместите усилительную пластину в первый слот адаптера пластины, убедившись, что адаптер правильно выровнен с пластиной в верхнем левом углу. Направьте пластину штрих-кодом вверх и к передней части прибора. После нажатия кнопки «Закрыть дверь» перейдите на вкладку «Домой» в нижней части экрана.

В меню «Выполнить» выберите OpenArray. Нажмите «Получить идентификаторы номерных знаков». Чтобы начать прогон, нажмите кнопку Начать прогон.

Откройте таблицу, содержащую макрос результатов. В экспортированном файле данных щелкните правой кнопкой мыши вкладку в нижней части экрана и выберите «Переместить» или «Копировать». В поле В книгу выберите макрос результатов.

Затем нажмите «Переместить» до конца и установите флажок «Создать копию». Наконец, нажмите OK. Удалите старую вкладку экспорта, а затем переименуйте вновь добавленную вкладку в экспорт.

Нажмите «Просмотр», затем «Макросы», выберите «Макрос», затем нажмите «Выполнить». Затем повторите это для Макроса2, нажав Просмотр, затем Макросы, выбрав Макрос 2 и нажав Выполнить. В программном обеспечении амплификатора проверьте кривые для каждого образца и управляйте по таблице макросов, выбрав график анализа/усиления в левой части экрана.

Затем выберите вкладку с образцами и нажмите на каждый образец, чтобы убедиться, что для каждого из положительных результатов в таблице есть две или три положительные кривые усиления. Показания флуоресценции сопоставляются с циклами амплификации, чтобы проиллюстрировать, что ПЦР в реальном времени была успешно выполнена. Большинство образцов достигли относительных пороговых значений между вторым и 25-м циклами ПЦР-реакции в реальном времени.

Строятся стандартные кривые, выполняемые в три разных дня, чтобы продемонстрировать линейность и диапазон усиления с использованием положительного контроля. Пороговые значения цикла построены относительно логарифмического основания 10 от числа копий стандарта нуклеиновой кислоты. Два макроса заполнят имена образцов в первом столбце и среднее значение трех значений Ct для каждой мишени для тех, у кого положительные результаты.

Целевые показатели, которые не были усилены, отображаются в этой таблице пустыми. Показаны количественные результаты для 10 клинических образцов и четырех рутинных контрольных показателей, как и в данном случае, отрицательный контроль амплификации должен быть отрицательным для всех мишеней, а отрицательный контроль экстракции должен содержать только внутренний контроль. Один образец в этом наборе показывает неудачный внутренний контроль, что указывает на наличие ингибиторов в образце.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперимент с наноразмерной ПЦР. Эта процедура облегчит проведение панелей на основе синдрома в ветеринарной диагностике. Этот метод может быть адаптирован для включения эссе о возбудителях многих различных инфекционных заболеваний.