Структурная информация от одной молекулы FRET Эксперименты с помощью быстрого нано-системы позиционирования

Общая цель системы быстрого нанопозиционирования заключается в предоставлении структурной информации о биомолекулах в режиме реального времени путем объединения экспериментов с одной молекулой FRET со строгим статистическим анализом. Этот метод отвечает на ключевые вопросы в области структурной биологии, такие как локализация гибких доменов в макромолекулах, где не могут быть применены стандартные инструменты биологии структуры. Основное улучшение быстрого NPS по сравнению с другими структурными инструментами на основе FRET заключается в том, что различные модели красителей могут быть сравнены, используя не только наиболее вероятные положения, но и трехмерное распределение вероятностей.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает структурные данные из базы данных белков с количественными измерениями флуоресценции отдельных молекул. Чтобы начать процедуру, соберите проточную камеру и держатель образца. Чтобы подготовить впускные и выпускные винты, вденьте силиконовые трубки в винты с полыми язычками и отрежьте трубку прямо с обоих концов лезвием бритвы.

Прикрутите винты с язычками к держателю образца. Совместите отверстия кварцевого ползуна проточной камеры с резьбой держателя образца. Аккуратно затяните винты держателя стекла, чтобы зафиксировать проточную камеру на месте.

Вденьте 20-сантиметровые отрезки силиконовой трубки во входной и выпускной винты. Промойте проточную камеру 500 микролитрами PBS. Затем промойте проточную камеру 100 микролитрами раствора нейтравидина в PBS, следя за тем, чтобы на конце входной трубки образовалась капля, предотвращающая попадание воздуха в камеру для образца.

Зажимайте входную и выходную трубки после каждой манипуляции, чтобы исключить попадание воздуха из проточной камеры. Выдержите камеру в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем смойте раствор нейтравидина 500 микролитрами PBS.

Добавьте каплю иммерсионного масла на призму и прикрутите призму к камере для образцов. Данные FRET для одной молекулы получают с помощью флуоресцентного микроскопа с полным внутренним отражением. Запустите программное обеспечение камеры и программное обеспечение сценического пьезомотора.

Установите камеру на микрометровый столик TIRF-микроскопа горизонтально, как можно прямее, и таким образом, чтобы она пересекала все три лазера. Добавьте иммерсионную жидкость и сфокусируйте объектив микроскопа, проверив ИК-отражения. Задайте параметры камеры, путь к файлу и параметры автоматического увеличения.

Запустите прямую трансляцию с камеры и обесцвечивайте фоновую флуоресценцию с помощью всех трех лазеров с полной интенсивностью. Затем уменьшите интенсивность лазера. Затем загрузите в камеру 100 микролитров раствора флуоресцентных шариков.

Подождите 10 минут, чтобы бусины прилипли к поверхности камеры. Запишите фильм с полем зрения от 50 до 100 бусин и выполните пакетный анализ с высоким порогом нахождения пика. Загрузите файл фильма и выберите две бусины с четкими центрами в противоположных углах поля зрения.

Выберите пиксели максимальной интенсивности в этих бусинах. Снимите и очистите призму. Подготовьте вторую камеру для образцов и прикрутите держатель призмы к камере.

Установите камеру на микрометровый столик. Затем загрузите в камеру 100 микролитров от 50 до 100 пикомолярного раствора биотинилированного флуоресцентно меченного образца. Подождите, пока молекулы свяжутся с поверхностью камеры.

Одновременно нажмите Take Signal для начала записи и включите лазер возбуждения донора. Отрегулируйте мощность лазера так, чтобы убедиться, что не менее 80% молекул в поле зрения обесцвечены, затем переместите камеру, чтобы показать необесцвеченную область, и запишите следующий фильм. Таким образом отбелите остальную часть камеры для образцов.

После измерений на TIRF-микроскопе необходимо проанализировать полученные данные об одномолекулярном FRET, чтобы получить среднюю эффективность FRET. Выполните пакетный анализ донорского и акцепторного фильмов образца. Затем загрузите пакетные файлы фильмов в программное обеспечение для анализа данных.

Нажмите на кнопку NOT Selected, чтобы указать отдельные фазы FRET. Нажмите на начало периода FRET, затем на временную точку, когда интенсивность акцептора снижается из-за обесцвечивания, и, наконец, на временную точку, когда интенсивность донора снижается из-за обесцвечивания. В следующем окне выберите Да, чтобы сохранить выбранную трассировку эффективности FRET.

После того, как каждая молекула будет проанализирована, сохраните следы и проанализируйте следующий фильм. После завершения анализа запустите скрипт для объединения результатов FRET. Импортируйте объединенный покадровый файл FRET в программное обеспечение для анализа данных, используя параметр ввода по умолчанию.

Постройте данные в виде гистограммы и используйте инструмент нелинейной аппроксимации кривой, чтобы подогнать их под гауссову. Значение exceed является основным показателем эффективности FRET. Используйте УФ-ВИД и флуоресцентную спектроскопию для определения изотропного радиуса Форстера и значений стационарной анизотропии для каждого красителя.

Система нанопозиционирования была вдохновлена хорошо известной системой GPS, поскольку мы локализуем неизвестное положение, антенну, с несколькими известными положениями, спутники. Чтобы начать анализ NPS, запустите программное обеспечение FastNPS и создайте новый файл задания. Чтобы определить априорное положение помеченных антенн и спутников, в окне ModelDyePrior введите пространственное разрешение определяемого положения.

Исключите внутреннюю часть макромолекулы, загрузив соответствующий центрированный PDB-файл. Введите диаметр красителя и расстояние скелетирования. Заполните координаты минимального и максимального положения возможного места расположения красителя.

Если определяется позиция спутника, выберите присоединение красителя через гибкий компоновщик и введите координаты атома из центрированного PDB-файла. Заполните длину и диаметр линкера. Нажмите «Рассчитать доступный объем», сохраните позицию до этого и экспортируйте ее для визуализации.

Повторите этот процесс для всех спутников и антенн. После того, как позиции будут определены, откройте окно «Определить измерение» и создайте новую молекулу красителя. Загрузите позицию, предшествующую этому красителю.

Заполните флуоресцентную анизотропию, выберите подходящую модель красителя и активируйте краситель. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будут определены все красители. Затем создайте новую мерку.

Выберите пару ладов из определенных красителей. Введите эффективность одной молекулы FRET с погрешностью, а также изотропный радиус Форстера этой пары красителей и активируйте измерение. Повторите это для всех пар красителей.

Далее откройте окно расчета. Если красители были назначены разным моделям, выберите «Определено пользователем». В противном случае выберите модель, которая будет использоваться для всех красителей.

Выполните расчет и откройте окно результатов. При использовании FastNPS важно помнить о необходимости адаптировать модели для всех красителей, чтобы свести к минимуму достоверные объемы, при этом, конечно, оставаясь последовательными. Если консистенция ниже 90 %, нажмите на детализированную консистенцию и определите красители, характерные для заявок с консистенцией менее 90 %.

Откройте окно «Определить измерение» и измените модель рассматриваемого красителя. Повторите расчет в режиме User Defined. Экспортируйте достоверные объемы красителей по отдельности или в виде партии.

Откройте файлы плотности в программном обеспечении для визуализации и настройте достоверность до нужного уровня. Эффективность одномолекулярного FRET была измерена между неизвестными молекулами антенны и несколькими известными молекулами-спутниками в открытом промоторном комплексе архейной РНК-полимеразы. Анализ NPS этих данных определил достоверные объемы этих молекул красителя относительно открытого промоторного комплекса архейной РНК-полимеразы.

Пять различных моделей, в которых использовались молекулы красителя, и результаты были сравнены. Достоверные объемы согласуются с измеренными данными при расчете с помощью моделей, которые предполагают, что краситель может свободно вращаться только в пределах конуса неизвестной ориентации. Классическая модель, в частности, является наиболее консервативной, поскольку она также предполагает, что краситель находится в фиксированном месте.

Это создает относительно большой достоверный объем, но объем обычно заключает в себе правильное положение. Модели с более высокой точностью исходят из предположения, что краситель полностью свободен во вращении в течение срока его флуоресценции. Модель iso, как и классическая модель, предполагает, что краситель находится в фиксированном положении в пределах доступного объема.

Модель meanpos-iso предполагает динамическое усреднение по всем возможным позициям. В то время как достоверные объемы моделей iso намного меньше, чем рассчитанные моделями без ISO, они не согласуются с измеренными данными. Мы хотели разработать метод, который позволил бы нам захватывать динамическую структурную информацию о переходных комплексах, что не могло быть решено существующими структурными инструментами.

После того, как данные об одномолекулярном FRET были записаны, анализ FastNPS выполняется за пару часов, что позволяет быстро сравнить различные модели красителей. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как MD-моделирование, для получения структурированных моделей, согласующихся с экспериментальными данными FRET на одной молекуле.