Синтез катионизированные Magnetoferritin для сверхбыстрое НАМАГНИЧЕННОСТИ клеток

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы синтезировать магнитную наночастицу внутри белковой клетки, а затем функционализировать белок таким образом, чтобы он обеспечивал быстрое прикрепление магнитной наночастицы к клеткам. Этот метод может быть использован для получения магнитных наночастиц, которые обеспечивают быструю и эффективную магнитную маркировку клеток, что важно для таких приложений, как МРТ или магнитное разделение клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что намагниченность клеток может быть достигнута с использованием низких концентраций наночастиц и короткого времени инкубации, что предотвращает потенциальные побочные эффекты из-за воздействия наночастиц.

Для начала деоксигенируйте 500 миллилитров деионизированной воды, поместив в воду трубку, подключенную к баллону с азотом, и запечатав сосуд пищевой пленкой. Затем продуйте газообразный азот в течение примерно 60 минут. Нагрейте водяную баню, подключенную к реакционному сосуду с двойной рубашкой, до 65 градусов Цельсия.

Затем добавьте в реакционный сосуд 75 миллилитров 50 миллимолярного буфера HEPES с pH 8,6. Загерметизируйте сосуд и обескислите кислород, пропуская газообразный азот через буферный раствор в течение примерно 20 минут. Одновременно размешайте буферный раствор с помощью магнитной мешалки.

После дезоксигенации буферного раствора HEPES извлеките азотную трубку из буфера, удерживая ее во взвешенном состоянии над раствором для поддержания атмосферы азота. Добавьте апоферритин для достижения конечной концентрации 3 миллиграмм на миллилитр. Продолжайте магнитное перемешивание, но уменьшите скорость перемешивания, если происходит пенообразование.

Для синтеза магнитоферритина с помощью двух шприцевых насосов одновременно вводится 10,1 миллилитров железо-кобальтового предшественника и 10,1 миллилитров перекиси водорода в раствор апоферритина со скоростью потока 0,15 миллилитров в минуту. Продолжайте выполнять шаги синтеза, как описано в текстовом протоколе. Затем загрузите образец в колонку, содержащую катионную матрицу, с помощью перистальтического насоса со скоростью потока 10 миллилитров в минуту.

Промойте колонку примерно 100 миллилитрами работающего буфера с помощью градиентного насоса со скоростью расхода 10 миллилитров в минуту. Чтобы разбавить белок, промойте колонку 150 миллилитрами возрастающей концентрации хлорида натрия и трис-буфера со скоростью 10 миллилитров в минуту. Поскольку белок элюирует при концентрации хлорида натрия 500 миллимоляров, соберите его на 50 миллилитровых фракций с помощью автоматизированного сборщика фракций.

Сконцентрируйте 150 миллилитров магнитоферритина до объема приблизительно два миллилитра с помощью центробежного фильтра объемом 15 миллилитров, а затем четырехмиллилитрового объемного блока. Обратитесь к инструкциям производителя по центробежным фильтрующим установкам для получения подробного протокола этой процедуры. Далее загрузите концентрированный образец на гелевую фильтрационную колонку с помощью инжекционного контура.

Промыть колонку с работающим буфером со скоростью потока 1,3 миллилитра в минуту. Соберите шесть миллилитровых фракций с помощью автоматизированного сборщика фракций. Белковые мономеры вымываются последними.

На этом этапе очищенный магнитоферритин может храниться при температуре четыре градуса Цельсия до катионизации. Для получения 10 миллиграммов магнитоферритина взвесьте 374 миллиграмма ДМПА и растворите в 2,5 миллилитрах 200 миллимолярного MES-буфера. Отрегулируйте pH раствора примерно до семи с помощью концентрированной соляной кислоты.

Токсичные пары выделяются при регулировке рН раствора ДМПА с помощью соляной кислоты. Обязательно обращайтесь с этими материалами в вытяжном шкафу. Добавьте 2,5 миллилитра раствора магнитоферритина по четыре миллиграмм на миллилитр.

Добавьте магнитную мешалку и помешивайте в течение двух часов, чтобы уравновесить. После доведения раствора до pH 5,0 добавьте 141 миллиграмм порошка EDC в раствор магнитоферритина DMPA. Продолжайте помешивать в течение трех с половиной часов.

Отфильтруйте раствор через шприцевой фильтр 0,22 микрона, чтобы удалить любые осадки и диализировать белок, как описано в текстовом протоколе. Культивирование hMSC в соответствии с текстовым протоколом. Вымойте покрытые ячейки двумя миллилитрами PBS комнатной температуры.

Затем добавьте один миллилитр стерилизованного катионизированного раствора магнитоферритина в покрытые клетки перед инкубацией в течение желаемого периода времени. Промойте клетки PBS, а затем соберите их, добавив 0,5 миллилитра трипсина-ЭДТА и инкубируя при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После добавления одного миллилитра питательной среды для инактивации трипсина ЭДТА, переложите раствор в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение пяти минут при 524-кратном G. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 0,5 мл магнитного сепарационного буфера.

Далее прикрепите магнит к мультистенду и добавьте к магниту магнитную разделительную колонку. Поместите фильтр предварительного разделения на столбец. Затем добавьте 0,5 миллилитра магнитного сепарационного буфера в фильтр предварительной сепарации и пропустите его через фильтр и колонку, чтобы промыть их.

Далее поместите под колонну центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте 0,5 миллилитра клеточной суспензии в фильтрующий резервуар магнитной разделительной колонны. Когда резервуар опустеет, добавьте 0,5 миллилитра магнитного сепарационного буфера. Когда резервуар снова опустеет, добавьте еще 0,5 миллилитра магнитного разделительного буфера.

Повторите промывку еще раз, чтобы общий объем магнитного сепарационного буфера составил 1,5 миллилитров. Эта ступень промывки вымывает все ненамагниченные элементы из колонки. Снимите колонку с магнита и поместите ее в свежую 15-миллилитровую центрифужную пробирку.

Затем снимите фильтр с резервуара колонки. Добавьте в резервуар 1 миллилитр магнитного разделительного буфера и сразу же протолкните колонку с помощью поршня, поставляемого производителем. При этом намагниченные элементы вымываются из колонки в центрифужную трубку.

Перейдите к количественному определению количества железа, как описано в текстовом протоколе. Изображения просвечивающей электронной микроскопии образцов магнитоферритина, окрашенных негативом, показали, что внутри белковой клетки образовались наночастицы. Измерения дзета-потенциала подтверждают, что магнитоферритин получил положительный поверхностный заряд после катионизации.

Воздействие на мезенхимальные стволовые клетки человека катионизированного магнитоферритина в течение одной минуты привело к намагничиванию 92% клеточной популяции и доставке 3,6 пикограммов железа на клетку. Увеличение времени инкубации до 15 минут приводило к намагничиванию всей клеточной популяции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться понимание того, как синтезировать магнитную наночастицу в полости апоферритина путем последовательного добавления предшественников солей металлов в белковый раствор.

А затем о том, как химически катионизировать белок с помощью связи TMPA. После освоения синтез, очистка и катионизация магнитоферритина могут быть выполнены за три дня, если они выполнены правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно избежать загрязнения кислородом и поддерживать правильную температуру и pH на протяжении всего синтеза магнитоферритина.

В результате этой процедуры другие грузы, такие как квантовые точки или терапевтические агенты, могут быть инкапсулированы в катионизированную клетку апоферритина для достижения более эффективной доставки этих материалов в клетки. Этот метод может проложить путь исследователям в области магнитных манипуляций с клетками к изучению магнитной маркировки в клетках, которые демонстрируют плохое поглощение наночастиц или которые очень чувствительны к длительному воздействию наночастиц или повышенным концентрациям наночастиц.