Синтез катионизированные Magnetoferritin для сверхбыстрое НАМАГНИЧЕННОСТИ клеток

Общая цель данного метода заключается в синтезе магнитной наночастицы внутри белковой оболочки с последующей функционализацией белка таким образом, чтобы обеспечить быстрое прикрепление магнитной наночастицы к клеткам. Этот метод может быть использован для создания магнитных наночастиц, которые позволяют осуществлять быстрое и эффективное магнитное мечение клеток, что важно для таких приложений, как МРТ или магнитная сепарация клеток. Основным преимуществом данной методики является то, что намагничивание клеток может быть достигнуто при использовании низких концентраций наночастиц и короткого времени инкубации, что предотвращает возможные неблагоприятные эффекты вследствие воздействия наночастиц.

Для начала дегазируйте 500 миллилитров деионизированной воды, поместив в воду трубку, подключенную к баллону с азотом, и герметично закрыв сосуд пищевой пленкой. Затем продувайте воду азотом в течение примерно 60 минут. Нагрейте водяную баню, подключенную к реактору с двойной рубашкой, до 65 °C.

Затем добавьте в реакционный сосуд 75 миллилитров 50 миллимолярного HEPES-буфера с pH 8.6. Плотно закройте сосуд и удалите кислород, продувая буферный раствор газообразным азотом в течение примерно 20 минут. Одновременно с этим перемешивайте буферный раствор с помощью магнитной мешалки.

После деоксигенации буферного раствора HEPES извлеките трубку с азотом из буфера, удерживая ее над раствором для поддержания азотной атмосферы. Добавьте апоферритин до достижения конечной концентрации 3 мг/мл. Продолжите магнитное перемешивание, но снизьте скорость перемешивания в случае появления пены.

Для синтеза магнитоферритина используйте два шприцевых насоса для одновременного введения 10.1 миллилитров предшественника железа-кобальта и 10.1 миллилитров перекиси водорода в раствор апоферритина со скоростью потока 0.15 миллилитра в минуту. Продолжите выполнение этапов синтеза согласно текстовому протоколу. Затем с помощью перистальтического насоса при скорости потока 10 миллилитров в минуту нанесите образец на колонку с катионообменной матрицей.

Промойте колонку примерно 100 миллилитрами промывочного буфера с помощью градиентного насоса при скорости потока 10 миллилитров в минуту. Для элюции белка промойте колонку 150 миллилитрами трис-буфера с возрастающей концентрацией хлорида натрия при скорости 10 миллилитров в минуту. Поскольку белок элюируется при концентрации хлорида натрия 500 миллимоляр, собирайте его фракциями по 50 миллилитров, используя автоматический сборщик фракций.

Сконцентрируйте 150 мл магнетоферритина до объема примерно двух мл, используя центрифужный фильтр объемом 15 мл, а затем блок объемом четыре мл. Подробный протокол данной процедуры приведен в инструкциях производителя центрифужных фильтров. Затем нанесите сконцентрированный образец на колонку для гель-фильтрации с помощью петли для ввода пробы.

Промойте колонку рабочим буфером при скорости потока 1.3 мл/мин. Собирайте фракции объемом по шесть миллилитров с помощью автоматического сборщика фракций. Мономеры белка элюируются последними.

На данном этапе очищенный магнитоферритин можно хранить при температуре four degrees Celsius до проведения катионизации. На 10 milligrams магнитоферритина отвешивают 374 milligrams DMPA и растворяют в 2.5 milliliters 200 millimolar MES-буфера. Доводят pH раствора примерно до семи, используя концентрированную соляную кислоту.

При корректировке pH раствора DMPA с помощью соляной кислоты выделяются токсичные пары. Обязательно работайте с этими материалами в вытяжном шкафу. Добавьте 2,5 milliliters раствора магнетоферритина в концентрации четыре milligrams per milliliter.

Добавьте магнитную мешалку и перемешивайте в течение двух часов для установления равновесия. После доведения pH раствора до 5,0 добавьте 141 мг порошка EDC к раствору магнитоферритина DMPA. Продолжайте перемешивание в течение трех с половиной часов.

Профильтруйте раствор через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм для удаления осадков и проведите диализ белка, как описано в текстовом протоколе. Культивируйте hMSCs согласно текстовому протоколу. Промойте высеянные клетки двумя миллилитрами PBS комнатной температуры.

Затем добавьте один миллилитр стерилизованного раствора катионизированного магнитоферритина к клеткам на планшете перед инкубацией в течение необходимого периода времени. Промойте клетки буфером PBS, после чего соберите их, добавив 0,5 миллилитра трипсина-ЭДТА и инкубировав при 37 °C в течение пяти минут. После добавления одного миллилитра культуральной среды для инактивации трипсина-ЭДТА перенесите раствор в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте в течение пяти минут при 524 ×g. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 0,5 миллилитрах буфера для магнитной сепарации.

Затем прикрепите магнит к многопозиционному штативу и установите в магнит колонку для магнитного разделения. Поместите фильтр для предварительного разделения в колонку. После этого добавьте 0,5 milliliters буфера для магнитного разделения на фильтр для предварительного разделения и дайте жидкости пройти через фильтр и колонку для их промывки.

Затем поместите центрифужную пробирку объемом 15 мл под колонку и добавьте 0,5 мл клеточной суспензии в резервуар для фильтрации колонки для магнитного разделения. Когда резервуар опустеет, добавьте 0,5 мл буфера для магнитного разделения. После повторного опорожнения резервуара добавьте еще 0,5 мл буфера для магнитного разделения.

Повторите промывку еще раз, чтобы общий объем буфера для магнитной сепарации составил 1,5 миллилитра. Этот этап промывки вымывает все немаркированные клетки из колонки. Снимите колонку с магнита и поместите ее в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем извлеките фильтр из резервуара колонки. Добавьте в резервуар 1 milliliter буфера для магнитной сепарации и немедленно пропустите его через колонку, используя поршень, прилагаемый производителем. Это позволит вымыть намагниченные клетки из колонки в центрифужную пробирку.

Перейдите к количественному определению железа, как описано в текстовом протоколе. Изображения образцов магнетоферритина с негативным контрастированием, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, показали, что внутри белковой оболочки сформировались наночастицы. Измерения дзета-потенциала подтверждают, что магнетоферритин приобрел положительный поверхностный заряд после катионизации.

Воздействие катионизированного магнитоферритина на мезенхимальные стволовые клетки человека в течение одной минуты привело к намагничиванию 92% популяции клеток и доставке 3,6 пикограмм железа на каждую клетку. Увеличение времени инкубации до 15 минут привело к намагничиванию всей популяции клеток. После просмотра этого видео вы должны понять, как синтезировать магнитную наночастицу внутри полости апоферритина путем последовательного добавления предшественников в виде солей металлов к раствору белка.

Затем следует химическая катионизация белка с помощью связывания с TMPA. После освоения метода синтез, очистка и катионизация магнетоферритина могут быть выполнены за три дня при условии правильного соблюдения протокола. При выполнении данной процедуры важно избегать загрязнения кислородом, а также поддерживать правильную температуру и pH на протяжении всего процесса синтеза магнетоферритина.

После выполнения данной процедуры в катионизированную оболочку апоферритина можно инкапсулировать другие грузы, такие как квантовые точки или терапевтические агенты, для обеспечения более эффективной доставки этих материалов в клетки. Этот метод может открыть исследователям в области магнитного манипулирования клетками возможность изучить магнитное мечение клеток, которые характеризуются плохим поглощением наночастиц или которые очень чувствительны к длительному воздействию наночастиц или повышенным концентрациям наночастиц.