SILAC основе Протеомный Характеристика экзосомы от ВИЧ-1-инфицированных клеток

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы охарактеризовать экзосомальный протеом из инфицированных ВИЧ-1 клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области биологии экзосом, такой как влияние внешних стрессов на состав протеома экзосомы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ей можно научиться даже при ограниченном опыте в области протеомики и биологии экзосом.

Хотя этот метод может дать представление о ВИЧ-инфекции, он также может быть применен к исследованиям других заболеваний, таких как бактериальные инфекции. В этом эксперименте используется клеточная линия H9, хотя можно использовать различные клеточные линии, если они находятся в активной стадии пролиферации и восприимчивы к выбранным условиям теста. Высевайте два раза по 10 до шестой стадии по девять клеток в каждую из двух колб для клеточных культур.

Вырастите одну популяцию на 10 миллилитров меченой среды, содержащей 10% стилизованного FBS, 100 мг на литр L-лизина, меченного C13, и 100 мг на литр L-аргинина, меченного C13 и N15. Выращивайте другую популяцию в 10 миллилитрах немеченой среды с 10% стилизованного FBS, L-лизина и L-аргинина. Выращивайте клетки в течение шести удвоений, после чего белки клеток в меченой среде более чем на 99% меченые тяжелые аминокислоты.

Добавляйте свежие носители или меняйте их через равные промежутки времени в зависимости от типа ячеек. По окончании мечения увеличьте объем культуры до 30 миллилитров, чтобы вместить рост большего количества клеток. Инфицируйте меченые клетки штаммом NL4-3 ВИЧ-1, используя стандартный протокол инфицирования ВИЧ-1.

Добавьте соответствующее количество вируса в клетки и инкубируйте в течение 48 часов, в то время как немеченые клетки продолжают расти в немеченой среде без инфекции ВИЧ-1. В конце инфекции ВИЧ-1 надосадочная жидкость из обеих клеточных популяций собирается для выделения экзосом. Соберите надосадочную жидкость культур в 50-миллилитровые конические пробирки, избегая клеток.

Центрифугируйте в течение 10 минут при 300-кратном g и четырех градусах Цельсия, чтобы удалить оставшиеся клетки. Соберите надосадочную жидкость в новые 50-миллилитровые конические пробирки и центрифугируйте в течение 10 минут при 2000 раз g для удаления омертвевших клеток. Перенесите полученные надосадочные жидкости в коммерческие совместимые с ротором пробирки, способные выдерживать ультрацентрифугирование.

Обязательно отбалансируйте ультрацентрифужные пробирки. Центрифугируйте пробирки в течение 30 минут при 10 000 перегрузках, чтобы удалить клеточный мусор. Соберите надосадочную жидкость в новые ультрацентрифужные пробирки.

Центрифугируйте в течение 70 минут при 100 000 г. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте каждую богатую экзосомами гранулу в пяти миллилитрах свежей PBS и переложите раствор в свежую ультрацентрифужную пробирку.

Снова центрифугируйте в течение 70 минут при 100 000 раз больше. После финального спина выбросьте надосадочную жидкость. Теперь клеточные гранулы готовы к экстракции белка.

Чтобы начать эту процедуру, растворите каждую изолированную экзосомальную гранулу в 100-200 микролитрах фер-па-лай-сез и экстракционный буфер с добавленными ингибиторами протеазы, которые могут ингибировать полный спектр протеаз. Центрифугируйте растворенные растворы в течение 10 минут при 13 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия. Переложите очищенную надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

После количественного определения концентрации белка в каждом образце с помощью стандартных анализов смешайте равное количество белков из меченых и немеченых образцов. Смешайте равную смесь с 4-20% гелем SDS-PAGE в течение 30 минут. Окрасьте гель синим цветом кумасси с последующим задержанием.

С помощью лезвия бритвы вырежьте дорожку для образца из геля, затем разрежьте дорожку для геля на 10-15 равных частей. Поместите каждую деталь в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, всего от 10 до 15 пробирок, и продолжайте процедуру экстракции белка, как описано в текстовом протоколе. Процедуры анализа протеомных данных не будут демонстрироваться, но кратко изложены на данной блок-схеме.

Экстрагированные белки сначала анализируют с помощью жидкостной хроматографии, тандемной масс-спектроскопии, а также оценивают качество данных. Затем данные предварительно обрабатываются путем удаления белков, которые содержат менее двух количественных пептидов. Затем идентифицируются значительно повышенные и пониженные белки.

Наконец, репликации значимых кандидатов сравниваются для достижения согласованности, и данные из всех реплик объединяются. Чтобы начать характеристику идентифицированных белков, используйте их регистрационные номера GenBank или идентификаторы UniProt для поиска по текущим базам данных экзосом. В этой демонстрации будет использоваться ExoCarta.

Нажмите «Запросить» и введите название гена или белка или номер доступа. Любые данные об экзосомах подтверждают, что белки-кандидаты ранее были обнаружены в экзосомах, и это добавляет уверенности в том, что кандидаты действительно находятся в экзосомах. Затем выполните поиск кандидатов по базе данных взаимодействия ВИЧ-1 и белков человека.

В поле для записи доменного имени белка введите имена кандидатов или номера доступа и нажмите кнопку «Поиск». Результаты поиска могут дать представление о взаимодействии между ВИЧ-1 и кандидатами на белки, а также предположить, кто из кандидатов может быть действительно связан с ВИЧ-1. Третий шаг — получить глобальное представление о кандидатах с помощью программного обеспечения для онтологии генов или анализа GO, такого как fun-brich.

В разделе «Анализ обогащения» нажмите «Добавить набор данных» и загрузите номера доступа GenBank или идентификаторы UniProt кандидатов, а затем выберите тип диаграммы для визуализации анализа GO. Результаты анализа ГО визуализируются в виде круговых диаграмм, которые предоставляют информацию о белках-кандидатах в области биологических процессов, клеточного компонента и молекулярной функции. Следующим шагом является выявление статистически перепредставленных терминов GO с помощью анализа DAVID.

Щелкните инструмент функционального аннотирования, введите список кандидатов и выберите идентификатор гена, например UniProt ID.Выберите список генов и выполните поиск. Когда поиск будет завершен, щелкните страницу сводных результатов аннотации в категории онтологии гена, чтобы просмотреть обогащенные термины GO, p-значения и другие параметры. Наконец, исследуйте потенциальные белок-белковые взаимодействия и возможные биохимические пути с помощью общедоступной базы данных STRING.

Введите идентификатор белка или последовательность в специальное поле поиска и выберите правильный вид для анализа. Нажмите «Поиск». Результаты дадут информацию как о прямых, так и о косвенных ассоциациях.

Первые 10 известных совпадений для экзосомального кандидата, отображаемых в результатах, должны быть рассмотрены для значимого выбора кандидата. Приведены репрезентативные результаты анализа набора из 14 белков методом DAVID. Обогащение биологическими процессами показало, что процессы, связанные со смертью клеток, значительно обогащаются.

Обогащение клеточным компонентом показывает множество белков внутриклеточного происхождения, а обогащение молекулярными функциями определило роль в связывании белков для большинства кандидатов. L-лактатдегидрогеназа В-цепи или LDHB была выбрана в качестве наиболее значимого кандидата, а анализ STRING определил 10 ведущих взаимодействующих партнеров LDHB. Большинство партнеров LDHB также были функционально и локально связаны с экзосомами у ВИЧ-1.

После освоения этой техники ее можно сделать за одну неделю, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выполнении каждого шага при правильной температуре и условиях. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как аффинная изоляция, чтобы подтвердить предсказания биоинформатического анализа.

После своего развития этот метод проложил путь для исследований в экзосомальной области для изучения изменений в экзосомном протеоме, связанных с инфекциями ВИЧ-1 в биологии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить экзосомы из клеточной культуры, проанализировать их протеомы и исследовать их связь с ВИЧ. Не забывайте, что работа с ВИЧ или другим инфекционным агентом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.