Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани

Развитие невропатической боли включает в себя патологические изменения спинного мозга глиальных клеток. Надежная система глиальных культуры происходит от взрослой ткани спинного мозга и предназначен для изучения этих клеток в пробирке отсутствует. Таким образом, мы покажем здесь, как установить первичные смешанные глиальные культуры от взрослых мышей ткани спинного мозга.

Общая цель этого протокола заключается в получении первичных смешанных глиальных культур из спинного мозга взрослых мышей для исследований in vitro. Этот метод предоставляет нам систему in vitro для исследования роли глиальных клеток в неврологических заболеваниях, связанных с патологическими изменениями в спинном мозге, такими как нейропатическая боль и рассеянный склероз. Основное преимущество этой методики заключается в том, что глиальные культуры получают из спинного мозга взрослой мыши, обеспечивая систему, которая более точно отражает условия in vivo.

Демонстрировать процедуру будет Дженнифер Малон, техник из моей лаборатории. Работая в капюшоне для культуры тканей, перенесите четыре спинных мозга мыши в чашку Петри с HBSS. С помощью стерильных ножниц и щипцов разрежьте каждый из спинных мозгов на мелкие кусочки.

Затем переложите кусочки в 50-миллиметровую коническую трубку, содержащую смесь ферментов папаина ДНКазы. Избегайте переноса HBSS в смесь ферментов, так как это может привести к снижению эффективности фермента. Крайне важно, чтобы кусочки ткани хорошо переваривались для получения одноклеточной суспензии.

Тем не менее, чрезмерное переваривание приведет к уменьшению количества жизнеспособных клеток. Каждая лаборатория должна провести пилотные тесты, чтобы определить точное время переваривания на основе того, что лучше всего подходит для их клеток. Затем осторожно сделайте трубку вихревой, а затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа с орбитальной тряской со скоростью 150 оборотов в минуту.

После инкубации сделайте трубку вихревой, а затем энергично растирайте ткань с помощью пятимиллилитровой пипетки, чтобы способствовать дальнейшей диссоциации. Затем переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте для 300 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Во время центрифугирования по 300 мкл восстановленного раствора ингибитора альбумина овомукоида до 2,7 мл АБСС в стерильную пробирку и хорошо перемешать.

Затем добавьте 150 микролитров раствора ДНКазы. После центифугирования удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу в свежеприготовленном ингибиторе овомукоидов альбумина и растворе ДНКазы. Вихревой колодец разбить ячейку с пеллетой.

Затем добавьте в клеточную суспензию три миллилитра восстановленного раствора ингибитора овомукоида альбумина, без ДНКазы. Центрифугируйте ячейки при 70 x g в течение шести минут при комнатной температуре. После отжима удалите надосадочную жидкость, которая содержит фрагменты мембраны, и сохраните гранулы.

Чтобы удалить миелин из диссоциированных клеток спинного мозга, сначала добавьте восемь миллилитров среды комнатной температуры 20% градиентной плотности в трубку, содержащую клеточную гранулу, и осторожно перемешайте. Затем центрифугируйте ячейки при давлении 800 х г в течение 30 минут при комнатной температуре без разрушения. После центрифугирования осторожно отсасывайте верхний слой мусора, который содержит в основном миелин и надосадочную жидкость, покидая гранулы.

Чтобы удалить оставшийся градиент плотности, промойте ячейки, повторно суспензировав гранулу восемью миллилитрами cDMEM, разведенными HBSS. Центрифугируйте клетки при 400 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость, и промойте клетки разведенным cDMEM, как и раньше.

После удаления надосадочной жидкости гранулу можно хранить на льду до засеивания клеток. Когда все будет готово к покрытию, ресуспендируйте клетки в 14 миллилитрах cDMEM, дополненных 2-меркаптоэтанолом. И добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку в 12-луночной пластине.

Планшеты с дополнительными лунками, которые можно использовать для определения среднего количества клеток в лунке и содержания микроглии в культуре. После того, как клетки будут покрыты, инкубируйте их при температуре 35,9 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Смените носитель на 1-й день, то есть на следующий день после нанесения покрытия.

Некоторые клетки прикрепляются к культуральной пластине, но они все же в основном круглые. Также имеется много плавающих ячеек и значительных обломков. Повторите смену среды через три-четыре дня после этого, пока клетки не будут готовы к лечению между 12 и 14 днями.

Смешанные глиальные клетки взрослых мышей C57 black six культивировали при температуре 37 градусов Цельсия или 35,9 градусов Цельсия и анализировали с помощью проточной цитометрии. Как вы можете видеть, нет никакой очевидной разницы в общем количестве клеточных популяций при этих температурах. Эти репрезентативные графики показывают CD45-положительные CD11b-положительные популяции микроглии, выделенные из общего количества клеточных популяций, показанных ранее.

Этот рисунок демонстрирует, что более высокое содержание микроглии может быть получено при культивировании смешанной глии при температуре 35,9 градусов Цельсия, а не 37 градусов Цельсия. Взрослый спинной мозг, смешанные глиальные культуры были получены от черных шести мышей C67. Показаны репрезентативные изображения культивируемых клеток на первый, четвертый, восьмой и 12-й дни.

Изображения, демонстрирующие типичный прогресс культуры, а также демонстрирующие важность средств массовой информации, меняются в первый день посткультурного становления. После освоения первоначальная настройка культуры клеток смешанной глии может быть завершена примерно за четыре часа, если она выполнена правильно. После создания культуры смешанной глии из этой первоначальной смешанной популяции могут быть получены культуры, обедненные микроглией и обогащенные микроглией.

Тем не менее, выход клеток, обогащенных микроглией, будет ограничен, если для создания культур не будет использовано большое количество спинного мозга. Этот метод был первоначально разработан для изучения роли глиальных клеток в развитии нейропатической боли. Тем не менее, он может быть использован для изучения других неврологических заболеваний, которые включают патологические изменения в спинном мозге взрослого человека.