Метод извлечения Пигменты из кальмаров Doryteuthis pealeii

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы описать, как извлечь пигменты, расположенные в наноструктурированных гранулах только что препарированных хроматофоров кальмара Doryteuthis pealeii. Головоногие моллюски — сложные морские животные, которые претерпевают быстрые и адаптивные изменения своего кожного цвета. и адаптивные изменения их кожного цвета.

Тем не менее, до сих пор многое неизвестно о том, как работают эти системы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он целенаправленно нацелен на наноструктурированные гранулы в хроматофорном органе. Это позволит исследователям выяснить механизм изменения цвета, возникающий на наноуровне.

В дополнение к пониманию биологии головоногих, он может помочь в разработке синтетических систем, созданных для имитации динамического диапазона адаптивного цвета, отображаемого у головоногих моллюсков, с использованием предварительно упакованных пигментированных наночастиц. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что сбор чистой хроматофорной ткани затруднен из-за ее близости к окружающей ткани. Наш метод оптимизирован для снижения содержания этих загрязняющих веществ.

Чтобы начать вскрытие, сначала налейте примерно 250 миллилитров фильтрованной морской воды в поддон для вскрытия. Поместите образец в кастрюлю и с помощью прямых ножниц тонкой точки из нержавеющей стали разрежьте от основания брюшной мантии вдоль задней стороны животного, заканчивая в области плавников. Удалите все внутренние органы, аккуратно приподняв их с помощью рассекающих щипцов и разрезав соединительную ткань с помощью ножниц.

Выбросьте органы в мешок для образцов. Используя рассекающие Т-образные штифты, прикрепите мантийный плавник вверх к подушечке для вскрытия. С помощью щипцов осторожно удалите непрозрачный слой кожи эпидермиса, сохраняя неповрежденным слой кожи, содержащий хроматофор.

Выбросьте эпидермальный слой в мешок для образцов. Далее снимаем слой хроматофора. Разрежьте ткань хроматофора на небольшие отрезки размером один сантиметр на один сантиметр.

Поместите срезы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, заполнив каждую пробирку наполовину рассеченной тканью. Наконец, добавьте в трубки 500 микролитров отфильтрованной морской воды. Чтобы выделить гранулы пигмента, сначала центрифугируйте срезы хроматофорной ткани в течение пяти минут при 14 000 x g.

Выбросьте верхний слой морской воды. Добавьте в образцы 500 микролитров раствора папаин-коллагеназы и сделайте вихрь в течение одной-двух минут на самой высокой температуре. Затем обрабатывайте образцы ультразвуком в течение пяти минут на частоте 40 кГц, чтобы отделить клетки от окружающих тканей.

Центрифугируйте еще пять минут при 14 000 x g, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Повторите центрифугирование еще два раза, каждый раз отбрасывая надосадочную жидкость. Затем добавьте ресуспендию в коллагеназу.

С помощью щипцов вручную удалите все оставшиеся большие участки ткани, которые не переварились, прежде чем продолжить. Чистота исходного гранулированного раствора влияет на экстракцию пигмента. Поэтому важно следить за тем, чтобы исходные хроматофорные материалы были полностью переварены.

Мы обнаружили, что срезы ткани около одного сантиметра являются оптимальными для сбора самой чистой популяции гранул. Приготовьте гомогенизационный буфер, взяв 150-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой и добавив соответствующее количество HEPES, хлорида магния, аспартата калия и дитиотреитола. Добавьте одну покупную мини-таблетку ингибитора протеазы.

С помощью мерного цилиндра отмерьте 100 мл деионизированной воды и добавьте ее в пробирку, содержащую соли гомогенизации. Вихревыми пробирками перемешивайте до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Центрифугируйте образцы тканей, а затем выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте по 500 микролитров гомогенизационного буфера в каждую пробирку и вортекс до 2 минут для тщательного перемешивания. Обрабатывайте образцы ультразвуком в течение 30 минут при частоте 40 кГц. А затем снова центрифугировать их.

После удаления надосадочной жидкости повторите добавление гомогенизации, ультразвуковую обработку и центрифугирование два-три раза, чтобы обеспечить полное переваривание внеклеточной ткани. Наконец, пробирка должна содержать светло-желтый надосадочный слой и гранулу красного цвета, состоящую из выделенных гранул пигмента. Выбросьте надосадочную жидкость.

Сначала приготовьте кислый метанол для экстракции в стеклянную пробу с завинчивающейся крышкой, добавив 5мл метанола и 25мкл концентрированной соляной кислоты. Аккуратно взболтайте раствор и перемешайте. Отложите одну пробирку с образцом, на этом будет заканчиваться прореагировавшая обработка гранулами.

Извлеките гомогенизационный буфер из второй пробирки, содержащей гранулы. Добавьте 500 мкл раствора кислого метанола в оставшиеся пробирки и заведите вихрь на три-четыре минуты. Обрабатывайте образцы ультразвуком в течение 10 минут при частоте 40 кГц, а затем центрифугируйте в течение пяти минут при напряжении 14000 x g.

С помощью микропипетки соберите надосадочную жидкость в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой объемом в один драм. Это и есть пигмент, и он должен иметь темно-красный цвет. Повторите шаги добавления кислого метанола, ультразвуковой обработки и центрифугирования четыре-пять раз, собирая надосадочную жидкость до тех пор, пока не исчезнет дополнительный цвет.

Оставшаяся бесцветная гранула представляет собой пигментные экстрагированные гранулы. Чтобы подготовить образцы гранул для визуализации, сначала центрифугируйте как непрореагировавшую гранулу аликвоту, так и гранулы, экстрагированные пигментом, в течение пяти минут при 14000 х г выбросьте надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте каждую гранулу в 1 мл 95% этанола. С помощью переводной пипетки поместите по 2-3 капли каждой гранульной суспензии на отдельный алюминиевый огрызок SEM.

Поместите образцы в эксикатор для сушки в течение ночи под вакуумом. Нанесите на огрызки золото-платиновое покрытие в течение 3 минут, чтобы получить покрытие толщиной 15 нанометров. Визуализируйте образцы с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Затем с помощью спектрофотометра соберите профили поглощения для непрореагировавших гранул, экстрагированных гранул и экстрагированного пигмента. Сделайте холостой замер для образцов гранул, добавив 1 мл деионизированной воды в чистую кювету. Выбросьте заготовку в контейнер для отходов.

Далее добавьте в кювету суспензию, содержащую непрореагировавшие гранулы пигмента. Соберите спектры поглощения в УФ-диапазоне для образца гранулы. Сделайте второй замер для извлеченного пигмента, используя 1 мл кислотного метанола и чистую кювету.

Наконец, возьмите абсорбирующий спектр УФ-видимого излучения для пигмента, а затем определите максимальную длину волны каждого образца. Сканирующая электронная микроскопия показала, что процесс экстракции пигмента уменьшает средний диаметр гранул. До экстракции гранулы имеют средний диаметр 527,3 нм.

После процедуры с кислотным метанолом этот размер значительно уменьшается примерно до 202,6 нм. Считается, что уменьшение происходит из-за экстракции пигмента. При добавлении кислотного метанола цвет, связанный с непрореагировавшими гранулами, также заметно уменьшается.

Подтверждение этой гипотезы было получено с помощью спектрофотометрии. На этом графике показан широкий профиль абсорбции для предварительно экстрагированных гранул и такой же широкий, но более низкий профиль интенсивности для постэкстрагированных гранул. Напротив, растворимый экстрагированный пигмент демонстрирует лямбда-макс на длине волны около 500 нм и отчетливое плечо на длине волны около 380 нм.

В совокупности эти данные свидетельствуют об успешном извлечении видимого цвета из гранул. После освоения этой техники можно выполнить примерно за четыре часа от начала до конца. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о полном удалении ткани, содержащей светоотражающие белковые тромбоциты, которые могут помешать извлечению и анализу.

Эпидермальная ткань также может препятствовать этапам гомогенизации и экстракции пигмента. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как тонкослойная хроматография и масс-спектрометрия, для дальнейшей очистки пигментов и определения их состава. Эти шаги могут помочь выяснить молекулярный вклад в окрашивание у головоногих.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы для морских биологов, химиков и инженеров, в том числе:Каков состав пигментов, используемых при изменении цвета? И как они влияют на функцию и структуру наноструктурированных гранул в дермальных хроматофорных органах? После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как извлечь пигмент из только что препарированных хроматофоров кальмара, doryteuthis pealeii.