Построение конечно-элементных моделей по расследованию данио рерио Щековые биомеханики

Общая цель этого метода моделирования — смоделировать механическую среду, в которой развиваются челюсти рыбок данио. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области опорно-двигательного аппарата, такие как: как модели механической нагрузки меняются с течением времени? И как эти нагрузки стимулируют поведение клеток.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет анализировать паттерны экспрессии генов и изменения в поведении клеток в контексте механической среды. Этот метод может дать представление о развитии скелета. Он также может быть применен к любой другой биологической структуре, которая испытывает механическую нагрузку, например, к скелетным элементам у высших позвоночных или к сердечно-сосудистой системе.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что терминология и программное обеспечение предполагают инженерное образование. Чтобы визуализировать форму скелетных элементов, количественно оценить мышечную массу и определить точное расположение мышечных прикреплений, иммуноокрашивание рыб в соответствующем возрасте на скелетный миозин и коллаген II типа. Сначала зафиксируйте личинку рыбы в 4% параформальдегиде и PBS на один час.

Затем смойте фиксатор с помощью двух смывок PBT. Затем обезвоживайте личинку в 50% метаноле и PBT в течение пяти минут, а затем в 100% метаноле в течение пяти минут. Затем личинки могут храниться в 100% метаноле до тех пор, пока они не понадобятся.

При необходимости регидратируйте личинку в 50% метаноле и PBT в течение пяти минут. Затем постирайте его в PBT в течение пяти минут. Теперь пеабилизируйте личинку 0,25% трипсином и ПБТ на льду в течение пяти-шести минут.

Затем промойте его в PBT в течение пяти минут и повторите стирку PBT еще три раза. Перед применением антител заблокируйте личинку на два-три часа в 5% сыворотке и ПБТ. Затем инкубируйте личинку в рекомендованном разведении коллагена кролика против II типа и мышиных антител против миозина с 5% сывороткой и PBT.

Проводите такую инкубацию в течение одного часа при комнатной температуре, или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. После применения первичных антител промойте личинку в PBT в общей сложности шесть раз в течение 15 минут за одну промывку. После того, как PBT умоется, нанесите 5% сыворотку и блок PBT на один или два часа.

Теперь нанесите вторичные антитела, впредь держа препарат как можно дольше в темноте. Используйте флуоресцентно меченые вторичные антитела против мышей и кроликов в 5% сыворотке и PBT. После применения вторичных антител промойте личинку в PBT шесть раз в течение 10 минут за одну промывку.

Любая личинка, которая окрашена в соответствии с описанием или экспрессирует флуоресцентные метки, теперь может быть визуализирована с помощью конфокального микроскопа следующим образом. Сделайте конфокальную картинку интересующей области с помощью объектива с 10-кратным увеличением и примерно 2,5-кратным цифровым зумом. Возбуждайте зеленый и красный каналы с помощью 488-нанометрового лазера и 561-нанометрового лазера.

Затем сделайте снимки с разрешением 512 квадратных пикселей с интервалом z-плоскости 1,3 микрона с тремя средними линиями. Около 100 z секций заполнят стек. Экспортируйте данные в виде стека изображений TIFF.

Откройте стек изображений TIFF и просмотрите все каналы в соответствующем программном обеспечении. Щелкните правой кнопкой мыши по хрящевому каналу, выберите ортосплит и создайте. Затем щелкните правой кнопкой мыши по хрящевому каналу и выберите «Обработка изображений», «Сглаживание и шумоподавление», выберите фильтр изображения и переключите «Сглаживание по Гауссу».

В окне проекта щелкните правой кнопкой мыши отфильтрованное изображение и выберите «Сегментация изображения», а затем отредактируйте новую метку. Создайте новую этикетку для каждого материала, например для хрящей и сустава. Затем выделите хрящевую область изображения с помощью инструмента «Волшебная палочка» с включенным переключателем «Все срезы» и используйте инструмент «Кисть», чтобы удалить шум с контуров.

Затем выберите область стыка с помощью инструмента кисть, назначьте ее компоненту стыка и повторите действие по всему стыку. Чтобы сгладить несколько срезов одновременно, выберите «Сегментация» в верхнем меню и выберите «Сгладить метки». Затем, чтобы создать 3D-рендеринг поверхности компонента, щелкните правой кнопкой мыши по изображению и выберите «Создать поверхность».

Теперь нажмите на визуализированную поверхность и сохраните данные в виде файла HMASCII для создания сетки software. 3D создание сетки является важным шагом в создании хорошей модели. Необходимо найти компромисс между сеткой, представляющей истинную форму структуры, которую вы пытаетесь смоделировать, не включая при этом столько деталей, чтобы ввести проблемные элементы, например, со слишком маленьким или слишком большим углом.

Чтобы создать сетку, импортируйте 3D-модель в соответствующий программный пакет. Чтобы создать двумерную сетку из хрящевых и суставных поверхностей, используйте инструмент «Термоусадочная пленка» в 2D-меню. Выберите размер элемента от 1,5 до 2,5.

Для оптимизации 3D-сетки можно создать ряд поверхностных сеток разного размера. Чтобы обеспечить непрерывность сетки между суставной и хрящевой поверхностями, все элементы на границе должны иметь общие узлы. Чтобы этого добиться, удаляют внутреннюю поверхность стыка, оставляя полую трубку.

Используйте функциональную клавишу F2 для доступа к ярлыку меню «Удалить элементы». Выберите элементы для удаления. Отрегулируйте граничные узлы в соответствии с поверхностью хряща.

Используйте комбинацию функциональных клавиш F2, F3 и F6 для удаления, перемещения узлов и создания новых элементов соответственно. Наконец, дублируйте поверхность хряща в месте сустава с помощью меню сборщика «Организуйте компоненты». Используйте функциональную клавишу F2 для удаления всех несоединенных элементов.

После этого выполните проверку качества, перейдя на панель «Проверить элементы». Проверьте наличие дубликатов элементов, вставок и проколов в сетке. Если они найдены, отредактируйте их с помощью вкладки «Инструменты».

Проверьте двугранные углы с помощью вкладки «Утилита», которая находится в параметре дерева модели. Чтобы создать 3D сетку из 2D поверхностных сеток разных размеров элементов, используйте инструмент Тетрамеш. Сравните различные размеры сетки и выберите модель КЭ с наименьшим размером сетки, которая сходится после дальнейшего моделирования и не влияет на определение элементов.

Далее, используя инструмент «Расстояние», преобразуйте сетку так, чтобы модель челюсти соответствовала масштабу. Убедитесь, что компоненты хряща и сустава соединены в модели, экспортировав объединенную модель или используя связи. Затем примените нагрузки, ограничения и свойства материала к модели КЭ, чтобы смоделировать функцию челюсти.

Используя обозначенные конфокальные стеки в качестве ориентира, определите мышцы. Во-первых, назначьте узлы, которые соответствуют точкам прикрепления мышц. Затем создайте векторы между узлами, которые представляют начало и прикрепление каждой мышцы.

После того, как все мышцы определены, создайте сборщик нагрузки и примените Cload к каждой мышце. Укажите величину в ньютонах и назначьте соответствующий вектор. Затем присвойте соответствующие упругие изотропные свойства материала, определенные литературой.

Затем создайте boundary loadcollector и примените некоторые начальные ограничения к модели. Выберите узлы, которые нужно ограничить, и выберите коэффициент степеней свободы, аналогичный естественному диапазону движений мышцы, определяемой этими узлами. Теперь создайте шаг нагрузки для каждого типа моделируемого движения.

В меню анализа выберите все соответствующие нагрузки и ограничения для моделирования заданного движения. Затем выберите статический режим в выпадающем меню. Когда все будет готово, экспортируйте модель в файл соответствующего формата, включая сетку, нагрузки, ограничения и свойства материала.

В этом случае выбирается формат INP. Затем загрузите модель в программное обеспечение для анализа конечных элементов. В нем можно создать и выполнить задание для модели, а также проанализировать выходные данные на предмет напряжения, деформации, смещения и т. д.

Выберите от трех до шести трансгенных личинок данио-рерио и слегка обезболите личинок 0,02% MS-222 до тех пор, пока они не перестанут реагировать на прикосновения, но их сердца все равно будут биться. Затем закрепите личинки сбоку на покровных листах в прохладной агарозе с низкой температурой плавления 1% в растворе Дано. Далее аккуратно удалите агарозу вокруг головы и челюсти с помощью щипцов.

Затем с помощью пастеровской пипетки смойте свежий раствор Даньо над головой личинки, чтобы удалить анестетик. Делайте это до тех пор, пока не возобновятся нормальные движения рта. Теперь используйте программное обеспечение для видеосъемки для съемки флуоресцентных высокоскоростных видео движений рта.

Снимайте с максимальной частотой кадров столько, сколько необходимо для записи нескольких циклов раскрытия челюсти. Позже проанализируйте максимальное смещение челюсти. Выберите рамки, которые показывают максимально открытую челюсть, и измерьте расстояние между передним кончиком хряща Меккеля и верхней челюстью.

Точка верхней челюсти соответствует кончику решетчатой пластинки. Иммуноокрашивание мышц и хрящей или визуализация трансгенных репортеров позволяет визуализировать 3D-структуру челюсти вместе с соответствующей мускулатурой. С помощью визуализации с высоким разрешением удалось построить модель, которая фиксирует трехмерную форму челюсти.

Модель включает в себя нагрузки, расположение и величина которых были получены на основе конфокальных изображений мышц и хрящей. С помощью этой модели был протестирован ряд различных свойств материала. Используя смещение in vivo, наблюдаемое с помощью высокоскоростного видеозахвата, была выбрана одна модель, которая лучше всего воспроизводит этот диапазон движения.

Используя наиболее точные данные о свойствах материала, нагрузках и форме сетки, модель КЭ была использована для изучения наилучшей оценки механической среды, происходящей в течение этого периода времени. Например, измерялись величины напряжения. Модель можно увеличить, чтобы увидеть мелкие детали узора, а затем просмотреть в цифровых сечениях, чтобы рассмотреть детали во всех измерениях.

После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как использовать конфокальную визуализацию для создания физиологически точной 3D-модели биологической структуры, которая подвергается механической нагрузке. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что это линейная, эластичная модель, и хрящ не ведет себя полностью как линейный материал. Другие свойства материала, такие как проницаемость, могут быть учтены, но могут потребовать дальнейших изменений сетки.