Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке изменений биопленок в ответ на мокроту и антибиотики. Этот метод может быть использован исследователями для понимания ключевых вопросов, например, как присутствие мокроты может повлиять на эффективность различных антибиотиков против бактериальных биопленок. Основное преимущество этой методологии заключается в том, что она позволяет людям видеть изменения, происходящие в биопленках в ответ на различные факторы.

Чтобы начать эксперимент, запишите объем ранее полученного образца мокроты. Добавьте фосфатно-солевой буфер или PBS, добавьте в два раза больше объема образца. Далее с помощью переводной пипетки тщательно перемешайте образец.

Ввергните образец на самую высокую настройку в течение одной минуты, чтобы полностью перемешать его. Разложите один миллилитр смеси по 1,5 миллилитровым микроцентрифужным пробиркам. Затем раскрутите трубки вниз.

После центрифугирования сохраните надосадочную жидкость и выбросьте гранулы. Фильтр простерилизует надосадочную жидкость через фильтр 0,22 микрона и соберет его в чистую микроцентрифужную пробирку. Храните надосадочную жидкость при температуре 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования.

Поместите 40 микролитров ранее приготовленной культуры в четыре миллилитра свежего бульона Лурия, или LB-среды, и вырастите бактерии, чтобы получить культуру с оптической плотностью 0,55 на 600 нанометрах. Далее разведите 100 микролитров культуры 0,5 OD в 400 микролитрах приготовленных 10%-ных фильтратов мокроты в LB. Используйте 200 микролитров разбавления для заделки лунок камер затвора. Дайте бактериям прикрепиться в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания.

Через четыре часа снимите носитель и аккуратно промойте биопленку 1X fresh LB. Замените оставшийся носитель 200 микролитрами свежего LB. Дайте биопленкам расти при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания. Заменяйте носитель каждые 12 часов без промывки, пока биопленка не будет готова к микроскопии. Очень важно аккуратно вымыть предметные стекла, чтобы не нарушить прикрепленные бактерии.

Следя за ростом, извлеките среду из камерных лунок и аккуратно промойте каждую камеру два раза 300 микролитрами стерильного PBS. Далее, чтобы приготовить смесь для окрашивания биопленкой, добавьте по одному микролитру каждого красителя, предусмотренного в наборе для определения жизнеспособности, на каждый миллилитр необходимого раствора и перемешайте раствор. Оптимальное количество красителя и время окрашивания определяется опытным путем для каждого организма.

Добавьте по 200 микролитров красящей смеси в каждую лунку камерного покровного стекла. Инкубируйте покровное стекло. После инкубации удалите окрашивающую смесь из камер и промойте каждую лунку 300 микролитрами стерильного ПБС.

Замените PBS на свежие среды. Наконец, приступайте к визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Репрезентативные изображения комплекса Burkholderia cepacia, или клинических изолятов БКК, после 48 часов роста в камерном покровном стекле только с использованием одной среды или в присутствии 10% фильтратов мокроты, демонстрируют, что их присутствие может изменить архитектуру биопленки.

Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения Comstat для получения ключевых параметров биопленки, в том числе средней толщины биопленки, которая увеличивалась при обработке 10% мокротой. Чтобы оценить влияние различных факторов на рост биопленки, клинические изоляты выращивали только в средах или с мокротой и обрабатывали антибиотиками или без них. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как формировать и обрабатывать биопленки на камерном покровном стекле и готовить их к окрашиванию и конфокальному анализу.