Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла
14 декабря 2016 г.
Этот протокол описывает визуализацию развития биопленки после воздействия факторов хозяина с использованием модели скользящей камеры. Эта модель позволяет напрямую визуализировать развитие биопленки, а также анализировать параметры биопленки с помощью компьютерных программ.
Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке изменений биопленок в ответ на мокроту и антибиотики. Этот метод может быть использован исследователями для понимания ключевых вопросов, например, как присутствие мокроты может повлиять на эффективность различных антибиотиков против бактериальных биопленок. Основное преимущество этой методологии заключается в том, что она позволяет людям видеть изменения, происходящие в биопленках в ответ на различные факторы.
Чтобы начать эксперимент, запишите объем ранее полученного образца мокроты. Добавьте фосфатно-солевой буфер или PBS, добавьте в два раза больше объема образца. Далее с помощью переводной пипетки тщательно перемешайте образец.
Ввергните образец на самую высокую настройку в течение одной минуты, чтобы полностью перемешать его. Разложите один миллилитр смеси по 1,5 миллилитровым микроцентрифужным пробиркам. Затем раскрутите трубки вниз.
После центрифугирования сохраните надосадочную жидкость и выбросьте гранулы. Фильтр простерилизует надосадочную жидкость через фильтр 0,22 микрона и соберет его в чистую микроцентрифужную пробирку. Храните надосадочную жидкость при температуре 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования.
Поместите 40 микролитров ранее приготовленной культуры в четыре миллилитра свежего бульона Лурия, или LB-среды, и вырастите бактерии, чтобы получить культуру с оптической плотностью 0,55 на 600 нанометрах. Далее разведите 100 микролитров культуры 0,5 OD в 400 микролитрах приготовленных 10%-ных фильтратов мокроты в LB. Используйте 200 микролитров разбавления для заделки лунок камер затвора. Дайте бактериям прикрепиться в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания.
Через четыре часа снимите носитель и аккуратно промойте биопленку 1X fresh LB. Замените оставшийся носитель 200 микролитрами свежего LB. Дайте биопленкам расти при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания. Заменяйте носитель каждые 12 часов без промывки, пока биопленка не будет готова к микроскопии. Очень важно аккуратно вымыть предметные стекла, чтобы не нарушить прикрепленные бактерии.
Следя за ростом, извлеките среду из камерных лунок и аккуратно промойте каждую камеру два раза 300 микролитрами стерильного PBS. Далее, чтобы приготовить смесь для окрашивания биопленкой, добавьте по одному микролитру каждого красителя, предусмотренного в наборе для определения жизнеспособности, на каждый миллилитр необходимого раствора и перемешайте раствор. Оптимальное количество красителя и время окрашивания определяется опытным путем для каждого организма.
Добавьте по 200 микролитров красящей смеси в каждую лунку камерного покровного стекла. Инкубируйте покровное стекло. После инкубации удалите окрашивающую смесь из камер и промойте каждую лунку 300 микролитрами стерильного ПБС.
Замените PBS на свежие среды. Наконец, приступайте к визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Репрезентативные изображения комплекса Burkholderia cepacia, или клинических изолятов БКК, после 48 часов роста в камерном покровном стекле только с использованием одной среды или в присутствии 10% фильтратов мокроты, демонстрируют, что их присутствие может изменить архитектуру биопленки.
Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения Comstat для получения ключевых параметров биопленки, в том числе средней толщины биопленки, которая увеличивалась при обработке 10% мокротой. Чтобы оценить влияние различных факторов на рост биопленки, клинические изоляты выращивали только в средах или с мокротой и обрабатывали антибиотиками или без них. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как формировать и обрабатывать биопленки на камерном покровном стекле и готовить их к окрашиванию и конфокальному анализу.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описываются методы визуализации и количественной оценки развития биопленки в ответ на воздействие мокроты и антибиотиков с использованием модели камеры на предметном стекле. Эта модель облегчает прямое наблюдение за изменениями биопленки и позволяет проводить детальный анализ с помощью компьютерного программного обеспечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Исследование биопленок
- Эффективность антибиотиков
Теоретическая часть
- Биопленки представляют собой сложные сообщества микроорганизмов.
- Понимание реакции биопленок на антибиотики имеет решающее значение для разработки стратегий лечения.
- Мокрота может влиять на эффективность действия антибиотиков против биопленок.
- Данное исследование направлено на эффективную визуализацию этих взаимодействий.
Цель исследования
- Визуализация изменений в биопленках под воздействием мокроты и антибиотиков.
- Количественная оценка влияния факторов хозяина на развитие биопленки.
- Углубление понимания эффективности антибиотиков против биопленок.
Используемые методы
- Сбор образцов мокроты.
- Разведение мокроты фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
- Перемешивание образцов для обеспечения однородности.
- Визуализация развития биопленки с использованием модели предметной камеры.
Основные результаты
- Прямая визуализация изменений биопленки в ответ на воздействие антибиотиков.
- Количественный анализ параметров биопленки.
- Изучение взаимодействия между мокротой и ответом биопленки.
- Демонстрация эффективности различных антибиотиков.
Выводы
- Модель с использованием предметных стекол эффективна для изучения динамики биопленок.
- Факторы хозяина, такие как мокрота, оказывают значительное влияние на поведение биопленок.
- Данная методология может лечь в основу будущих стратегий антибактериальной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная визуализация развития биопленки в присутствии мокроты хозяина и антибиотиков позволяет решить критическую проблему в поиске противоинфекционных средств и обеспечении точности трансляционных моделей. Данный подход способствует механистическому снижению рисков, раскрывая, как факторы хозяина модулируют эффективность антибиотиков и архитектуру биопленки, что дает информацию для валидации мишеней на ранних стадиях и разработки стратегий скрининга. Метод обеспечивает прогностическую уверенность при принятии решений по портфелю разработок в области инфекционных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы относительно влияния факторов хозяина на устойчивость биопленки.
- Способствует биологическому снижению рисков путем количественной оценки ответа биопленок на антибиотики в матрицах, релевантных для заболевания.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней путем измерения жизнеспособности и архитектуры биопленки в определенных условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем биопленок для последующего скрининга соединений в присутствии клинически значимых факторов.
- Стандартизация условий анализа для обеспечения воспроизводимости и количественного сравнения между экспериментальными группами.
- Получение достоверных количественных показателей, таких как толщина и жизнеспособность биопленки, для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит модели биопленок in vitro в соответствие с условиями среды хозяина, характерными для заболевания, что улучшает трансляционную преемственность.
- Поддерживает обоснованное с учетом рисков продвижение исследований, выявляя эффективность антибиотиков в сложных биологических матриксах.
- Обеспечивает понимание механизмов взаимодействия «хозяин-патоген-препарат» для прогностического снижения рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель с камерным покровным стеклом интегрируется в континуум от фундаментальных исследований до доклинических испытаний, позволяя проводить проверку гипотез об эффективности антибиотиков в биопленочных системах, имитирующих условия организма хозяина.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о влиянии факторов хозяина и уточнять механизмы формирования биопленок.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные для приоритизации соединений в контексте биопленок.
- Аналитика: предоставляет измерения на основе изображений и статистические данные для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклиническими моделями путем включения релевантных матриксов заболеваний.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированную адаптируемую платформу для повторной оценки стратегий борьбы с биопленками.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неопределенность механизмов в исследованиях и разработках противоинфекционных средств.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов биопленок.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет выявления контекстно-зависимой эффективности препаратов.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе их эффективности в системах, имитирующих условия в организме хозяина.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами биопленок, конфокальной микроскопией и количественным анализом изображений.
- Необходим доступ к системам с камерами на покровных стеклах, наборам для окрашивания на жизнеспособность и аналитическому программному обеспечению, такому как Comstat.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и визуализации.
- Может потребоваться адаптация для различных видов бактерий или матриц, производных от организма хозяина.
- Результат зависит от эмпирической оптимизации параметров окрашивания и визуализации для каждого организма.
