Визуальное ткани интерреналовой стероидогенных и его сосудистой микросреду в данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении дифференцированных межпочечных стероидогенных клеток у развивающихся рыбок данио с помощью простого анализа ферментативной активности. Эта процедура окрашивания может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся молекулярных и клеточных механизмов образования и мальформаций межпочечных желез. Основное преимущество этого анализа окрашивания заключается в том, что он быстрый, простой и надежный, что делает его мощным инструментом для генетического или химического скрининга у рыбок данио.

Эта процедура может быть выполнена на трангенных флуоресцентных репортерных линиях, маркирующих почки и кровеносные сосуды, чтобы можно было проанализировать несколько тканей в одном и том же эмбрионе. В сочетании с вибратомным срезом, иммуногистохимией и конфокальной микроскопией также можно визуализировать сосудистое микроокружение межпочечной ткани. После приготовления исходных растворов для окрашивания с тремя бета-ГСД активностями в соответствии с текстовым протоколом поместите развивающиеся эмбрионы данио-рерио в 0,03% ПТУ в яичную воду для подавления образования пигмента.

Фиксируйте дехорионированные эмбрионы, или личинки, в 2% или 4% PFA в PBS с 0,1% Tween 20, или PFAT. С помощью PBST промойте эмбрионы четыре раза по 10 минут каждый, следя за тем, чтобы образцы не высыхали между промывками. Перед реакцией окрашивания свежие части А и В подготовьте в отдельных пробирках, затем сделайте вихревую обработку и центрифугируйте растворы.

Очень важно подготовить детали А и В в отдельных пробирках. Добавление всех компонентов непосредственно в одну пробирку сразу же вызовет сильные осадки. Добавьте всю пробирку части А ко всей пробирке части Б. Хорошо перемешайте и сразу же распределите по одному миллилитру в каждую микропробирку, содержащую фиксированные и промытые эмбрионы.

Оберните трубки алюминиевой фольгой и поместите их при комнатной температуре на вращатель или качающуюся платформу с легким встряхиванием. Опытным путем определяют время реакции с помощью микроскопа для мониторинга хромогенных сигналов. Со временем будут развиваться незначительные осадки, которые не будут мешать процессу реакции.

Остановите реакцию, промыв эмбрионы четыре раза по 10 минут с помощью PBST, а затем закрепите окрашенные эмбрионы 4% PFAT при комнатной температуре в течение 60 минут. Для микроскопии всего монта используйте 50% глицерин в PBS для очистки эмбрионов. Затем, ориентировав их тыльной стороной вверх, наблюдайте за образцами с помощью вертикального микроскопа при ярком освещении поля.

Очистите зародыш от желтка, и с его помощью подготовьте плоское крепление. Затем сделайте изображение морфологии межпочечной ткани с высоким разрешением. Для анализа сосудистого микроокружения стероидогенной ткани проводят постфиксацию окрашенных эмбрионов 2%-ным PFA.

Дополните его 1% Triton X-100 при четырех градусах Цельсия в течение одного часа и используйте PBST-X для промывания эмбрионов при комнатной температуре четыре раза по 10 минут каждый. Чтобы внедрить эмбрионы, приготовьте 4%-ную малоплавкую агарозу, растворив агарозу в PBS при 95 градусах Цельсия. Затем разложите по микроцентрифужным пробиркам и храните при температуре от четырех до восьми градусов Цельсия.

Растопите аликвоту 4%-ной легкоплавкой агарозы при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут, затем держите аликвоту при температуре 47 градусов Цельсия. Используя в качестве формы отсоединенную крышку от микроцентрифужной пробирки объемом 1,5% миллилитров, погрузите эмбрион в расплавленную агарозу и дайте ему остыть до твердого состояния. Чтобы провести секционирование вибратома, приклейте лист бумажной ленты к сухой платформе вибратома.

Затем с помощью лезвия бритвы удалите затвердевший агарозный блок из формы. Нанесите суперклей на бумажную ленту на платформе, и закрепите агарозный блок на бумажной ленте передней стороной образца вверх. Затем обрежьте агарозный блок до формы трапециевидной призмы примерно от четырех до восьми миллиметров с каждой стороны верхней и нижней граней соответственно.

Используйте пипетку, наполненную холодным PBS с 0,5% Trident X-100, чтобы промыть агарозный блок. Затем с помощью вибратома в соответствии с инструкциями производителя подготовьте срезы размером 100 микрометров. С помощью иглы 26-го калибра удалите отрезанные участки из вибратома и перенесите их на пятнистую пластину, содержащую 500 микролитров холодного 0,5% PBST-X на лунку.

Соберите три среза тканей с положительной активностью бета-ВГД, проверив их под микроскопом для вскрытия, и с помощью наконечника пипетки перенесите срезы в 96-луночный планшет, содержащий холодные 0,5% PBST-X. Далее окрашиваем и рисуем участки в соответствии с текстовым протоколом. Чтобы определить, как стероидогенная межпочечная ткань развивается совместно с пронефрическим клубочком почки и его зарождающейся сосудистой сетью, был проведен анализ ферментативной активности трех бета-Hsd на двойном трансгенном эмбрионе данио-рерио, экспрессирующем как почечно-специфическую, так и эндотелиаль-специфическую флуоресценцию.

Как показано на рисунке, три бета-ГСД-положительные стероидогенные ткани расположены справа от средней линии и непосредственно прилегают к пронефрическому клубочку почки. Некоторые стероидогенные клетки также начинают мигрировать через срединную линию. Эти срезы вибратома трансгенных эмбрионов, экспрессирующих эндотелиальный GFP, подвергнутые трем анализам бета-Hsd, были проанализированы с помощью иммуногистохимии для обнаружения фибронектина и его нисходящего эффектора, фосфорилированной фокальной адгезионной киназы.

Отложение фибронектина в перидорсальной аорте имеет важное значение для поддержания роста межпочечных сосудов. Для эмбриона или личинки рыбы полное гистохимическое окрашивание может быть выполнено в течение одного дня, если оно выполнено правильно. Несмотря на то, что этот метод окрашивания прост и быстр, важно помнить, что он обнаруживает только один фермент стероидогенного пути.

Если целью является анализ развития межпочечной ткани, в дополнение к этому анализу, необходимо будет провести заселение in situ для обнаружения экспрессии других важных генов, участвующих в стероидогенезе.