Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов In Vitro

Общие цели этого метода заключаются в получении и идентификации in vitro культивируемых гигантских фагоцитов, полученных из циркулирующих нейтрофилов человека, для исследования их роли в воспалительных и противовоспалительных иммунных реакциях. Этот метод может быть использован для получения и идентификации новой субпопуляции гигантских фагоцитов, которые развиваются из нейтрофилов человека для поддержания длительных условий культивирования. Этот метод может быть использован для дальнейшего изучения значения и функций гигантских фагоцитов, а также для ответа на ключевые вопросы об их активации и пластичности.

Демонстрировать процедуру будут Ева Ледер, наш научный сотрудник, и Оксана Роговой, постдок, обе из моей лаборатории. Используйте стерильный набор вен кожи головы, чтобы получить не менее 40 миллилитров венозной крови от здорового молодого добровольца. Затем аккуратно перемешайте кровь в биобезопасном ламинальном колпаке.

Разбавьте от 10 до 12 миллилитров аликвот образца цельной крови до конечного объема 24 миллилитра с предварительно подогретым безионным PBS, содержащим 2% инактивированную теплом FCS. Затем добавьте 12% миллилитров полисахарозы 1119 на дно одной 50-миллилитровой стерильной полипропиленовой конической центрифужной пробирки на каждую аликвоту образца крови, после чего осторожно наложите 12 миллилитров полисахарозы 1077 поверх градиентного раствора полисахарозы 1119. Осторожно пипеткой нанесите 24 миллилитра разведенной крови на отдельные пробирки с градиентом плотности растворов и разделите клетки центрифугированием.

Следует наблюдать два образующихся непрозрачных слоя. Слейте жидкость на расстояние до 0,5 сантиметра над слоем мононуклеарных ячеек в каждой пробирке. Затем перенесите мононуклеарные ячейки из каждого образца в одну новую пробирку.

Затем отбросьте оставшуюся жидкость на расстоянии до 0,5 сантиметра над полиморфноядерной ячейкой или слоем PMN и перенесите PMN из каждого образца в новую пробирку. Промыть PMN в окончательном объеме 30 миллилитров PBS, содержащего 2% инактивированного теплом FCS, с последующим лизисом эритроцитов тремя миллилитрами стерильного ледяного гипотонического 0,2% хлорида натрия. После 30 секунд на льду восстановить изотоник с помощью трех миллилитров стерильного ледяного 1,6% натрия хлорида.

Затем добавьте шесть миллилитров 37 градусов Цельсия RPMI 1640 Medium с добавлением тепловой инактивированной ФТС и соберите клетки методом центрифугирования. Ресуспендируйте гранулу в четырех миллилитрах RPMI 1640 с добавлением 10% термоинактивированной FCS. После подсчета отрегулируйте концентрацию от 1,25 до 1,5 умножить на 10 до шестой ПМН на миллилитр питательной среды и поместите один миллилитр клеток на лунку в отдельные лунки 24-луночного планшета.

Затем поместите планшет во увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, подкармливая культуры путем щадящей замены половины среды свежей средой RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной теплом FCS каждые три дня. Нейтрофилы дифференцируются в гигантские фагоциты в течение семи дней после культивирования. На седьмой день посева тщательно удалите половину среды из каждой лунки.

Затем энергично пипетируйте оставшуюся среду, чтобы удалить слегка прилипшие гигантские фагоциты. Переложите отделенные ячейки из двух-четырех лунок каждой группы обработки в отдельные 15-миллиметровые конические пробирки и соберите ячейки центрифугированием, суспендируя гранулы в количестве от 100 до 120 микролитров среды на пробирку. Затем оснастите два-три держателя на каждую группу лечения предметными стеклами, фильтрующими картами и воронками.

Далее добавьте весь объем клеток из каждой пробирки в соответствующую воронку Cytospin. Затем загрузите держатели на Cytospin и закрутите клетки на предметных стеклах. Просушите закрученные горки в течение 10 минут.

Затем с помощью водостойкого маркера нарисуйте гидрофобный барьер вокруг клеток и закрепите образцы с 4% параформальдегидом под химическим колпаком при комнатной температуре. Через 10 минут кратко промойте предметные стекла три раза, добавив около 100 микролитров PBS на одну стирку. Затем проникните клетки 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем промывайте пять PBS, как показано выше.

Блокируйте неспецифическое связывание с помощью 10% нормальной козьей сыворотки в среде RPMI 1640 на соответствующий период времени с последующим однократным промыванием PBS. Теперь добавьте в коробку небольшое количество воды для поддержания влажности, а затем пометьте клетки примерно 100 микролитрами соответствующего первичного антитела, представляющего интерес, на ночь при температуре четыре градуса Цельсия во влажной темной камере. Затем выполните однократную промывку PBS, а затем добавьте соответствующее флуоресцентное конъюгированное вторичное антитело.

Через 40 минут при комнатной температуре, защищенной от света, промойте образцы для удаления излишков антител и установите предметные стекла с одной каплей монтажного материала на образец и покровным стеклом. Анализируйте предметные стекла с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии в течение 30–120 минут под объективом с 40-кратным погружным маслом. Затем рассчитайте площадь клеток, интенсивность флуоресценции и колокализацию с помощью соответствующего программного обеспечения.

На этих изображениях можно наблюдать развитие нейтрофилов в гигантские фагоциты в течение семи дней после культивирования. Аутофагоцитоз проявляется уже через 90 минут после культивирования нейтрофилов, при этом флуоресцентные мембранные красители со значительно увеличенным диаметром клеток становятся заметными уже на четвертый-седьмой день. Однако, если к культурам нейтрофилов добавить GM-CSF и IL-4, клетки демонстрируют в целом меньший диаметр и цитоплазматические проекции, напоминающие дендритные клетки.

Покадровая микроскопия гигантских фагоцитов на третье-четвертый и четвертый-пятые дни культивирования не обнаруживает или слабо адгезивные клетки с ограниченной подвижностью, которые активно поглощают окружающие нейтрофильные остатки и мусор. В этой смешанной культуре нейтрофилов моноцитов миграцию активно ползущего макрофага можно сравнить с почти неподвижным движением флуоресцентно меченного гигантского фагоцита в той же культурной лунке. Нейтрофильное происхождение гигантских фагоцитов может быть проверено по их положительной экспрессии отсутствия нейтрофильных маркеров и недостаточной экспрессии маркеров моноцитарных и дендритных клеток.

Гигантские фагоциты также генерируют базальные активные формы кислорода и реагируют на стимуляцию зимозаном и PMA окислительным взрывом. Однако, в отличие от моноцитов или нейтрофилов, они также реагируют окислительными всплесками на стимуляцию окисленных липопротеинов низкой плотности. После освоения этой техники ее можно освоить за шесть-семь дней.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости осторожной замены половины среды при кормлении культур нейтрофилов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы окрашивания, чтобы ответить на вопросы о дополнительных функциях этих интригующих клеток in vitro, а также in vivo. Этот метод может проложить путь исследователям в области биологии нейтрофилов к изучению активации и пластичности нейтрофилов, а также к идентификации этих клеток in vivo в физиологических и патофизиологических условиях у человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить и идентифицировать гигантские фагоциты в культуре. Пожалуйста, не забывайте, что работа с человеческой кровью может быть потенциально заразной, и что при выполнении этой процедуры необходимо соблюдать такие меры предосторожности, как ношение перчаток и выброс всех жидкостей и использование одноразового оборудования в соответствующие контейнеры для биологической опасности.