Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность

Общая цель этого протокола заключается в использовании одной комбинации анализа в режиме реального времени для идентификации специфических низкомолекулярных ингибиторов внутриклеточного бактериального роста, которые не токсичны для клеток-хозяев. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области открытия противомикробных препаратов. В частности, какие типы соединений могут проникать во внутриклеточные компартменты и убивать патогены, не нанося вреда клетке-хозяину?

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что токсичность клеток бактерий млекопитающих обнаруживается одновременно с помощью неразрушающих анализов в режиме реального времени. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с масштабируемостью, которую он предоставляет. Анализ более десяти тысяч соединений за сеанс требует совершенно нового набора техник и оборудования.

Помимо Люциуса, общую приверженность академическим открытиям в области противомикробной терапии и трансляционной диагностической микробиологии демонстрируют постдокторанты К.. Смит, Юн-Сук Канг, Дженнифер Цанг, Теа Бреннан-Крон и студентка Кэт Труэлсон. Для получения клеток-хозяев проводят культуру J774A. 1 макрофаг находится в суспензии в RPMI 1640, с девятью процентами обогащенной железом телячьей сыворотки.

Первоначально пассаж клеток в колбах с тканевыми культурами. После того как клетки слились в колбе для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров в 15 миллилитров среды, разделите клетки, соскоблив и разбавив их до 65 миллилитров тем же типом среды. Верните 15 миллилитров в колбу для культуры тканей и переложите 50 миллилитров в бактериальную колбу объемом 250 миллилитров.

Аэрируйте с установкой скорости вращения примерно 120 оборотов в минуту. Для стабильного роста инкубируйте ровно при пяти процентах углекислого газа и 37 градусах Цельсия. Собирайте клетки, когда они достигают плотности в диапазоне от двух целых пяти миллионов клеток на миллилитр до пяти миллионов клеток на миллилитр.

Убедитесь, что процент мертвых клеток не превышает 25 процентов, так как мертвые клетки будут увеличивать фоновый шум при анализах цитотоксичности. Крайне важно предотвратить оседание клеток в резервуарах, когда вы дозируете большие объемы макрофагов и бактерий с помощью обработчиков жидкостей. Завихревайте резервуары каждые несколько минут во время дозирования, чтобы избежать неоднородности и лунок пробирной пластины.

Планшет для клеток в культуре белых тканей обработан 384 луночными микропланшетами по 50 000 клеток в 30 микролитрах среды для культуры тканей на лунку. Инкубируйте микропланшеты в течение ночи, чтобы достичь девяносто процентов слияния в день эксперимента. Подготовьте участки бактерий для экспериментов, густо распределив микроорганизмы на новой пластине BCYE и инкубируя их в течение одного дня для получения слияний роста.

Повторно суспендировать организмы в той же питательной среде для тканей, которая использовалась для клеток J774A.1. Для проведения макрофагальной инфекции добавьте исследуемые соединения, представляющие интерес, в том числе скрининговые соединения, а также положительные и отрицательные контрольные группы для ингибирования роста бактерий при лизисе эукариотических клеток.

Исходные растворы должны быть растворены в количестве, превышающем или равном 500x в ДМСО или водном растворе, чтобы обеспечить достаточное разбавление транспортного средства. Разбавьте люминесцентные бактерии до целевого уровня 2 целых 5 миллионов КОЕ на миллилитр в среде для культивирования тканей. Затем добавьте соответствующий нетоксичный мембранный непроницаемый нуклеиновый кислотный краситель для обнаружения в двух целых пять раз в конечной концентрации анализа.

Добавьте по 20 микролитров этой смеси в каждую культуру луно. Конечный объем анализа составляет 50 микролитров, а конечная концентрация бактерий должна составлять один миллион КОЕ на миллилитр для репортера люксового эпрона или четыре миллиона КОЕ на миллилитр для репортера флуоресцентных белков. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-трех дней в пятипроцентном углекислом газе при 100-процентной относительной влажности, чтобы предотвратить эффект испарения.

Чтобы избежать связанных с температурой краевых эффектов при считывании результатов анализа, термически равновесьте микропланшеты перед считыванием люминесценции, поместив их в один слой на лабораторный стол с приоткрытыми крышками примерно на 20 минут. Считывайте данные о бактериальном росте и токсичности эукариотических клеток на микропланшетном люминометре и флуорометре в соответствии с требованиями используемых репортеров. Верните микропланшеты в инкубатор, если требуется считывание данных в режиме реального времени в более поздние моменты времени.

Анализируйте данные так, как описано в текстовом протоколе. Для экспериментов по тестированию реакции на дозу и синергии подготовьте макрофаги в бактериях, как и раньше. Непосредственно перед инфекцией макрофагов или аксенической инкубацией используйте автоматизированную систему обработки жидкости для облегчения ответа на одну дозу в комбинаторном синергетическом тестировании, настроенном путем прямого автоматического добавления антимикробных разведений в соответствии с протоколом производителя.

Добавьте противомикробные препараты, представляющие экспериментальный интерес, в серию серийного удвоения разведения. Цель состоит в том, чтобы охватить, на высоком уровне, концентрацию, которая полностью исключает рост, и на низком уровне, концентрацию, которая не проявляет явной активности. Здесь представлены репрезентативные результаты с течением времени для бактериальной люминесценции и флуоресценции, связанной с цитотоксичностью.

Обратите внимание на контрастные эффекты антимикробной обработки и цитотоксического детергента эукариотических клеток. Для определения селективности к антибиотику доксициклину использовали двойное определение реакции на дозу IC50 и CC50 в одних и тех же скрининговых лунках. Репликация бактерий ингибировалась промежуточными концентрациями антибиотика.

Однако цитотоксичность наблюдалась при высоких концентрациях, соответствующих селективности около 100. Тот же формат анализа был использован для проверки двумерной реакции на дозу комбинаций миноциклина и азитромицина. Изоконтуры соединяют точки равного ингибирования внутриклеточного роста.

Здесь вогнутые изоконтуры свидетельствуют о сильных синергетических эффектах для двух препаратов. Цифровая робототехника для настройки анализа, считывания данных в режиме реального времени и высокопроизводительный формат позволили провести комбинаторное тестирование тройной синергии. В данном случае наблюдение отчетливо вогнутой поверхности позволяет предположить высокую степень синергетического эффекта комбинаций миноциклина, азитромицина и рифампицина против внутриклеточного роста легионеллы феумофилы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как сочетать считывание флуоресцентного или люминесцентного анализа с тестированием цитотоксичности в режиме реального времени в формате высокопроизводительного анализа. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как конфокальный микроскоп, чтобы ответить на вопросы о биологических событиях во всей клетке, которые также локализованы с их антимикробной активностью или цитотоксичностью всей клетки. Хотя мы изучали влияние на репликацию легионеллы, те же методы могут быть применены и к другим внутриклеточным патогенам, таким как бруцеллы и микробактерии.

Впервые мы пришли к этому протоколу, когда пытались разработать анализ, достаточно простой и надежный, чтобы его можно было использовать в формате скрининга с очень высокой пропускной способностью. Не забывайте, что работа с бактериальными патогенами, клеточными линиями и роботизированным оборудованием сопряжена с некоторыми неотъемлемыми рисками, и следует принимать соответствующие меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты при выполнении этой процедуры.