Наблюдение и Количественное брачного поведения в Pinewood нематоды, Bursaphelenchus xylophilus

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы наблюдать за брачным поведением сосновой нематоды Bursaphelenchus xylophilus. Этот метод может помочь продвинуться в психологических исследованиях нематоды. В частности, речь идет о наблюдении за брачным поведением сосновой нематоды.

Главное преимущество этой методики заключается в том, что можно получить девственных взрослых особей, что значительно облегчает наблюдение за брачным поведением взрослых особей. Последствия этого метода распространяются исключительно на более широкое изучение нематод, потому что они имеют схожее поведение в жизненных циклах. Для демонстрации этого метода крайне важно так как приобретение девственных взрослых нематод затруднено, так как ограничения развития нематод требуют практики, а точно отличить самцов от самок у молодых особей на ранних стадиях первой стадии непросто.

Для культивирования сосновых нематод сначала готовят картофельную декстрозу агаровыми пластинками. Чтобы сделать прививку пластине, пробейте кусок грибкового мата диаметром 10 миллиметров из мата betritus senaria и поместите его в середину новой пластины PDA. Культивируйте грибковый коврик в течение пяти дней при температуре 25 градусов Цельсия в темноте.

Через пять дней добавьте сосновых нематод в подготовленную чашку Петри и выращивайте их в течение трех дней при температуре 25 градусов Цельсия в темноте. Чтобы изолировать нематод от грибка, сначала приготовьте средство для сбора. Поместите зажатую резиновую трубку под воронку, а подготовленную воронку подержите в стойке для сборки аппарата воронки Бермана.

Затем поместите два слоя фильтровальной бумаги вместо марли в горлышко воронки. Теперь перенесите грибковые культуры в воронку и добавьте воду до тех пор, пока грибковый мат не будет погружен. Через два часа нематоды выйдут из грибковой культуры, пересекут фильтровальную бумагу и поселятся в самой нижней части воронки Бермана.

Соберите нематод, поместив 15-миллилитровую трубку ниже воронки, затем медленно отпустите зажим, чтобы собрать несколько капель воды, в которой будут содержаться нематоды. Центрифугируйте скопления нематод при 3000 G в течение двух минут при комнатной температуре. Затем обеспылите верхний уровень воды, и снова суспендируйте червей в одном миллилитре воды.

Переложите суспензию нематод в шестисантиметровую стеклянную посуду и добавьте три миллилитра воды, чтобы помочь нематодам свободно плавать. Теперь собираем яйца, чтобы сделать девственные бульоны. Переложите блюдо в темный инкубатор, и дайте беременным самкам отложить яйца в течение 10 минут.

Из-за их гликопротеиновой поверхности яйца будут прилипать к стеклу. Далее аккуратно удалите воду с червями, чтобы не потревожить прилипшие к посуде яйца. Затем быстро добавьте обратно 3 миллилитра воды в блюдо, чтобы яйца не высохли.

Повторите этот процесс очистки яиц не менее трех раз, чтобы удалить всех личинок и взрослых особей и получить чистые яйца. К промытому чистому яичному сбору добавьте пять миллилитров воды, и приступайте к выявлению яиц в темноте при температуре 25 градусов Цельсия. Через 24 часа после начала культивирования яиц соберите вылупившихся личинок J2.

Аккуратно переложите личинки J2 в 15 миллилитровую трубку. Затем центрифугируйте сбор при 3000 G в течение двух минут. Спарьте верхний слой воды, и добавьте обратно 200 микролитров воды.

Затем культивируйте личинки J2 на планшете PDA, приготовленном с помощью грибного мата. Через 52 часа большая часть личинок J2 разовьется в личинки J4 на ранней стадии. Соберите воронку Бермана и извлеките нематод из грибковых культур в течение двух часов, как описано ранее.

Пока ждете, приготовьте иголку для ковыряния червей. Нарисуйте наконечник из стеклянного капилляра, нагретого над спиртовой горелкой. Кончик должен быть около 50 микрон в диаметре, что примерно соответствует ширине тела взрослой нематоды.

Через два часа переложите личинки J4 в чистую чашку Петри, как описано ранее. Теперь займитесь сексом с нематодами под стереомикроскопом. Около двух третей личинок обычно составляют самки.

Анатомия женской вульвы, очевидно, отличается от анатомии самца, но поскольку черви очень активны, определение пола потребует практики. Наиболее важным шагом в этом протоколе является точное различение и отделение самцов от самок на ранней первой стадии. В противном случае, когда они станут взрослыми, будут смешанные и плохие.

И это затрудняет наблюдение за случкой. Постепенно подбирайте и перекладывайте червей в каплю воды на горку для самцов или самок. Чтобы обеспечить успех, два разных человека должны дважды проверить распределение полов.

Теперь переложите каплю воды, содержащую сексированных червей, на соответствующую грибковую культуральную пластину. Затем культивируйте девственниц в течение еще 24 часов, прежде чем изучать их брачное поведение. Чтобы понаблюдать за брачным поведением сосновых нематод, сначала подготовьте несколько вогнутых горок, добавив по 200 микролитров воды в каждую из их лунок.

Далее выберите одну подготовленную девственницу и перенесите ее на подготовленную горку. Подержите взрослых девственниц в колодце в течение часа, чтобы они могли адаптироваться к новой водной среде. Через час добавьте в лунку одну взрослую девственницу противоположного пола, используя пипетку.

Затем понаблюдайте за поведением при спаривании под стереомикроскопом и запишите поведение на видео для количественного анализа. Весь процесс спаривания обычно заканчивается за два часа. Каждые 30 минут добавляйте 50 микролитров воды, чтобы компенсировать испарение.

Чтобы исследовать брачный выбор и межполовую конкуренцию, сгруппируйте и наблюдайте за девственными нематодами двух различных комбинаций. Успешность спаривания взрослых девственниц составила около 87%, что намного выше, чем у случайно выбранных взрослых. Парам требовалось в среднем 83 минуты, чтобы завершить весь процесс спаривания, который состоит из четырех различных фаз.

Поиски, контакты, совокупления и промедления. В рамках этих фаз можно наблюдать множество специфических моделей поведения. Когда одна самка встречалась с несколькими самцами, возникал очевидный брачный выбор.

Самка обычно использует свою голову для контакта с одним самцом, обычно в области головы, тела, хвоста и гениталий. Затем самка совокуплялась с самцом или быстро покидала его и подплывала к другому самцу. Показатели успешности спаривания измерялись после первого контакта для различных комбинаций нематод.

Также имело место межсексуальное соперничество. Когда одна девственная самка смешивалась с тремя девственными самцами, самцы старались приблизиться и контактировать с самкой как можно больше, чтобы получить возможность спариваться с ней. Когда вульва была занята, другие самцы пытались нарушить процесс спаривания, используя сильные раскачивания тела или перетаскивание, чтобы разнять их.

Было замечено, что женская интерсексуальная конкуренция более или менее похожа на мужскую интерсексуальную конкуренцию. Из-за межполовой конкуренции частоты совокуплений с различными комбинациями значительно отличались. После своего развития этот метод проложил путь к исследованию поведенческой экологии у нематод.

После освоения эта процедура может быть завершена за 12 дней, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о точном отделении самцов от самок, то есть на ранних четырех стадиях, чтобы получить девственных взрослых