Оценка Биоэнергетической функции в церебральный эндотелиальных клеток сосудов

Общие цели этой процедуры заключаются в том, чтобы оценить, как изменения функции митохондрий влияют на развитие неврологических расстройств, и разработать терапевтические средства, которые оказывают непосредственное влияние на отверстия гематоэнцефалического барьера. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологических расстройств, например, как можно свести к минимуму гибель нейрональных клеток после инсульта? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает оценку функции митохондрий в целых интактных клетках в режиме реального времени.

После выращивания эндотелиальных клеток сосудов головного мозга в полной среде, в колбе для культуры тканей площадью Т75 сантиметров, при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до 80% конфлюенции, выбросьте среду для клеточной культуры и промойте клетки трипсином ЭДТА. Затем добавьте в колбу один-два миллилитра свежего трипсина ЭДТА и отделите клетки при температуре 37 градусов Цельсия на три-пять минут. После подтверждения того, что клетки подняты под инвертированным микроскопом, остановите реакцию с осторожно добавлением 10 миллилитров свежей полной клеточной среды и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования.

Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу в 10 миллилитрах свежей полной питательной среды для еще одного центрифугирования. Затем повторно суспендируйте гранулу в полной питательной среде в концентрации от двух до 10 до 10 клеток на миллилитр для субкультуры. После соответствующего количества субкультур высейте 1,6 раза по 10 до четвертой клетки по 80 микролитров полной среды на лунку на 96-луночный планшет для культивирования внеклеточных клеток и поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Когда клетки прикрепились к пластине, добавьте интересующую обработку в соответствующие лунки и верните клетки в инкубатор. За день до анализа митохондриальной функциональной оценки увлажните картридж с внеклеточным потоком 150 микролитрами раствора калибранта внеклеточного потока и инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа. На следующее утро с помощью станции промывки пластин измените среду для культивирования клеток на среду для анализа внеклеточного потока pH 7,0.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия, без углекислого газа, в течение 30-60 минут. Когда клетки сбалансируются, загрузите гидратированный картридж в биоанализатор и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать калибровку. По окончании калибровки нажмите на подсказку Разблокировать картридж, чтобы снять нижнюю пластину картриджа и загрузить пластину ячейки.

Затем откройте файл данных, чтобы получить значения скорости от биоанализатора для экспорта в файл электронной таблицы. Учитывая, что кинетика и относительная интенсивность реакций варьируются среди различных типов эндотелиальных клеток сосудов головного мозга, в этих экспериментах был проведен ряд концентраций bEnd. 3 клетки использовали для определения оптимального количества клеток для измерения уровня потребления кислорода в метаболическом профилирующем анализе.

Как было замечено, базальное и максимальное дыхание и резервная дыхательная способность демонстрируют пропорциональную реакцию на плотность клеток. Продукция АТФ, однако, снижается при использовании самой высокой концентрации клеток в лунке, что позволяет предположить, что чрезмерно слитая клеточная культура не подходит для эксперимента. При этом оптимальные плотности ячеек, по-видимому, имеют место в среднем диапазоне количества клеток на лунку.

Таким образом, ожидаемые уровни потребления кислорода были оценены в этом репрезентативном эксперименте с использованием средней концентрации клеток, что продемонстрировало, что некодирующие молекулы-предшественники мРНК снижают митохондриальную функцию в эндотелиальных клетках сосудов головного мозга. Эти эксперименты также показывают, что максимальное дыхание и резервная способность значительно снижаются из-за чрезмерной экспрессии этих молекул в эндотелиальных клетках сосудов головного мозга через 24 часа после трансфекции, даже несмотря на то, что базальное дыхание, продукция АТФ и утечка протонов не демонстрируют существенных изменений. После освоения этой техники ее можно освоить за два дня.

От покрытия клеток до доступа к митохондриальной функции, если она выполнена правильно. Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить, что определение оптимальной плотности клеток чрезвычайно важно, прежде чем начинать какие-либо другие процедуры. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как анализ жизнеспособности клеток или гликолитический анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы об изменениях, происходящих в функции митохондрий из-за снижения жизнеспособности клеток или изменений в других метаболических путях.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области функции митохондрий для использования интактных клеток внутри изолированных митохондрий и при различных заболеваниях, включая неврологические заболевания, рак или метаболические нарушения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить доступ к функции митохондрий в эндотелиальных клетках сосудов головного мозга.