Цефоперазон обработанных мышей Модель Клинически значимых

Общая цель данного протокола — предоставить пошаговое руководство по созданию мышиной модели инфекции Clostridium difficile, индуцированной цефоперазоном, с особым акцентом на мониторинге клинических проявлений заболевания, подсчете количества бактерий, цитотоксичности токсинов и гистопатологических изменениях после заражения. Этот детальный протокол поможет исследователям точно реализовать мышиную модель инфекции Clostridium difficile, что необходимо для изучения патогенеза данной бактерии и оценки новых терапевтических средств. Основным преимуществом использования этой мышиной модели является то, что пятидневное воздействие одного антибиотика делает мышей восприимчивыми к колонизации C.difficile и обеспечивает продолжительное клиническое течение инфекции, сходное с заболеванием у людей.

Для начала возьмите интересующий вас стоковый штамм C.difficile и перемешайте его на вортексе. В ламинарном шкафу разведите сток в стерильной воде в пробирке с завинчивающейся крышкой до концентрации 10⁵ спор на 25 µL. Маркируйте смесь как споровый инокулят и поместите пробирку в водяную баню при 65 °C на 20 минут.

Затем в ламинарном шкафу перенесите 50 µL подогретого инокулята спор в стерильную микроцентрифужную пробирку и поместите ее в анаэробную камеру до дальнейшего использования. Остаток инокулята спор наберите в шприц объемом 1 mL, к которому прикреплена стерильная игла для желудочного зондирования с закругленным концом. В ламинарном шкафу возьмите подопышную мышь и зафиксируйте голову, осторожно удерживая животное за свободную кожу шеи и спины.

С помощью указательного пальца, следя за тем, чтобы животное не издавало звуков и не проявляло признаков стресса, дополнительно зафиксируйте голову животного и вытяните пищевод. Удерживая мышь в вертикальном положении, осторожно введите иглу для зондового кормления в угол рта. Направляйте иглу вдоль неба и медленно продвигайте ее в пищевод.

Когда игла будет введена примерно на половину длины в пищевод, введите 25 µL инокулята спор, после чего осторожно извлеките иглу. Поместите животное обратно в клетку и понаблюдайте за ним на предмет появления признаков кашля или респираторного дистресса, которые могут указывать на непреднамеренное введение в трахею. Затем возьмите аликвоту инокулята спор, хранившуюся ранее в анаэробной камере, а также остатки инокулята спор для зондового введения, и prepare серию из одного-десяти десятикратных разведений в 180 µL 1x PBS.

Выполните от четырех до пяти таких разведений. Используя асептическую технику, перенесите по 100 µL каждого серийного разведения на отдельные чашки с TCCFA. Каждый раз используя новый стерильный L-образный шпатель, равномерно распределите инокулят разведения по каждой чашке.

Инкубируйте чашки в анаэробных условиях в течение 24 часов при 37 °C. В завершение подсчитайте количество колоний C.difficile на каждой чашке с разведением и рассчитайте количество колониеобразующих единиц, чтобы определить инфекционную дозу, введенную мышам. Для сбора образцов фекалий мышей с целью анализа сначала аккуратно, но крепко зафиксируйте подопытную мышь, взяв ее за свободную кожу на шее и спине, следя за тем, чтобы животное не испытывало стресса.

Аккуратно приподнимите хвост животного мизинцем, открывая доступ к анусу. Удерживайте стерильную микроцентрифужную пробирку с известным весом непосредственно под анусом животного, следя за тем, чтобы пробирка не касалась мыши. Когда животное сходит в туалет, соберите фекальный пеллет в пробирку.

Храните пробирку при комнатной температуре до момента сбора всех необходимых образцов. Взвесьте пробирки с фекалиями на аналитических весах и запишите массу с точностью до четырех знаков после запятой. Вычислите массу фекального пеллета, вычтя вес пробирки.

Затем рассчитайте разведение содержимого от 1:10 и ресуспендируйте его в 1x PBS. С помощью кончика пипетки аккуратно разбейте фекальные массы в растворе. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы содержимое осело.

Поддерживая анаэробные условия для растворов, подготовьте серийные разведения для каждого образца в 1x PBS. Перенесите по 100 µL каждого серийного разведения на чашки с TCCFA. Используя стерильный L-образный шпатель, равномерно распределите суспензию по поверхности среды.

Инкубируйте чашки в анаэробных условиях при 37 °C в течение 24 часов. В завершение подсчитайте количество колоний C.difficile и вычислите количество колониеобразующих единиц на грамм содержимого кишечника. На данном рисунке показана масса мышей в дни после заражения C.difficile R20291.

В день 0 исходный вес принимается за 100. Средняя масса тела мышей измерялась ежедневно в течение последующих 14 дней. Значительное снижение веса наблюдалось у мышей, подвергшихся воздействию, со второго по седьмой день после заражения.

После этого момента мыши, по всей видимости, начали восстанавливаться и набирать вес. Здесь показана нагрузка C.difficile в фекалиях в дни после заражения. Через 24 часа после заражения у всех мышей была зафиксирована колонизация в размере 10 to the seventh CFUs на грамм фекалий.

Эта нагрузка снизилась с седьмого дня и далее, хотя C.difficile всё еще присутствовал. Гистопатологическое исследование мышей в течение всего периода инфекции выявило наиболее значимые патологические изменения в слепой кишке. Общие гистологические показатели слепой кишки значительно различались между нулевым днем и вторым и четвертым днями после заражения.

Как правило, специалисты, впервые работающие с данной моделью мышей, могут испытывать трудности с расчетом и приготовлением инокулята спор, используемого для инфицирования мышей, а также с расчетом бактериальной нагрузки C.difficile в фекалиях. При выполнении данного протокола важно помнить, что изменение дозы или штамма спор C.difficile, вводимых мышам, может повлиять на результаты данной модели.