Цефоперазон обработанных мышей Модель Клинически значимых Clostridium несговорчивый Штамм R20291

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы предоставить пошаговое руководство по реализации модели инфекции Clostridium difficile у мышей с цефоперазоном, уделяя особое внимание клиническому мониторингу заболевания, подсчету бактерий, цитотоксичности токсинов и гистопатологическим изменениям после проведения испытаний. Этот подробный протокол поможет исследователям точно выполнить мышиную модель инфекции Clostridium difficile, которая имеет важное значение для изучения патогенеза этой бактерии и доступа к новым методам лечения. Основное преимущество использования этой мышиной модели заключается в том, что воздействие одного антибиотика в течение пяти дней делает мышей восприимчивыми к колонизации C.difficile и к длительному клиническому течению инфекции одновременно с заболеванием человека.

Для начала возьмем интересующий нас штамм C.difficile и вихрь. В ламинарной вытяжке разведите подвой в стерильной воде в пробирке с завинчивающейся крышкой до концентрации от десяти до пятой части спор на 25 микролитров. Пометьте смесь как споровый инокулюм и поместите пробирку на водяную баню при температуре 65 градусов Цельсия на 20 минут.

Далее в ламинарном проточном колпаке пипеткой впрыскиваем 50 микролитров нагретого спорового инокулюма в стерильную микроцентрифужную пробирку и пропускаем ее в анаэробную камеру до дальнейшего использования. Загрузите оставшийся инокулят споры в одномиллилитровый шприц, прикрепленный к стерильной игле желудочного зонда с наконечником колбы. В ламинарном капюшоне возьмите мышь и обездвижите голову, мягко удерживая животное за рыхлую кожу шеи и спины.

Используя указательный палец, убедившись, что животное не издает звуки и не проявляет признаков стресса, еще больше обездвижите голову животного и удлините пищевод. Удерживайте мышь в вертикальном положении и осторожно вводите иглу зонда в боковую часть рта. Направьте иглу зонда вдоль нёба и медленно продвигайте её в пищевод.

Как только игла будет введена примерно на полпути в пищевод, введите 25 микролитров спорового инокулята, а затем осторожно извлеките иглу. Верните животное в клетку и осмотрите его на предмет любых признаков кашля или респираторного дистресса, которые могут указывать на непреднамеренное введение трахеи. Затем возьмите аликвоту спорового инокулюма, хранящуюся ранее в анаэробной камере, и любой оставшийся зондовый инокулюм споры и сделайте от одного до десяти последовательных разведений в 180 микролитрах 1x PBS.

Выполните четыре-пять таких разведений. Используя асептический метод, перенесите 100 микролитров каждого серийного разведения в отдельную пластину TCFFA. Взяв каждый раз новый стерильный Г-образный разбрасыватель, равномерно распределите разведение инокулята на каждой пластине.

Инкубируйте планшеты в анаэробных условиях в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, подсчитайте колонии C.difficile на каждой разбавляющей пластине и рассчитайте колониеобразующие единицы для получения инфекционной дозы, вводимой мышам. Чтобы собрать образцы кала у мышей для оценки, сначала легко, но крепко удерживайте мышь за рыхлую кожу на шее и спине, чтобы животное не испытывало стресса.

С помощью мизинца аккуратно приподнимите хвост животного, обнажив анальное отверстие. Держите стерильную микроцентрифужную пробирку известного веса непосредственно под анальным отверстием животного, следя за тем, чтобы трубка не касалась мыши напрямую. Когда животное испражняется, соберите каловые гранулы в пробирку.

Храните пробирку при комнатной температуре до тех пор, пока не будут собраны все необходимые пробы. Взвесьте пробирки с калом на аналитических весах и запишите массу с точностью до четырех знаков после запятой. Рассчитайте вес фекальной гранулы, вычтя вес трубки.

Затем рассчитайте разбавление содержимого от одного до десяти и повторно суспендируйте в 1x PBS. С помощью кончика пипетки аккуратно раздавите каловые массы в раствор. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут, дав содержимому отстояться.

Поддерживая растворы в анаэробном состоянии, производят серийные разведения для каждого образца в 1x PBS. Перенесите по 100 микролитров каждого серийного разведения на планшеты TCFFA. Используйте стерильный Г-образный разбрасыватель и равномерно нанесите средство на пластины.

Инкубируйте планшеты в анаэробных условиях при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Наконец, перечислите колонии C.difficile и рассчитайте колониеобразующую единицу на грамм содержания фекалий. На этом рисунке показан вес мыши в течение нескольких дней после испытания с C.difficile R20291.

В нулевой день базовый вес устанавливается равным 100. Средняя масса тела мыши измерялась каждый следующий день в течение 14 дней. Значительное снижение веса наблюдалось у мышей со второго по седьмой день после заражения.

Мыши, по-видимому, восстанавливались и снова набирали вес после этого момента. Здесь показана нагрузка C.difficile в кале в течение нескольких дней после испытания. Через 24 часа после заражения все мыши были колонизированы с 10 до 7 КОЕ на грамм фекалий.

К седьмому дню эта нагрузка уменьшилась, хотя C. difficile все еще присутствует. Гистопатологическое обследование мышей на протяжении всей инфекции показало наиболее значимые патологические изменения в слепой кишке. Общие гистологические показатели слепой кишки значительно различались между нулевым днем и вторым и четвертым днями после заражения.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой мышиной моделью, могут испытывать трудности с расчетом и приготовлением спорового инокулюма, используемого для борьбы с мышами, и расчетом фекальной бактериальной нагрузки C.difficile. При использовании этого протокола важно помнить, что модификации дозы или штамма спор C.difficile, вводимых мышам, могут изменить результат этой модели.