Оптимизированный протокол для электрофоретической подвижности Сдвиг Пробирной с помощью ИК-флуоресцентным красителем-меченных

Общая цель данного анализа заключается в обнаружении белково-ДНК-взаимодействий с использованием нерадиоактивных зондов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биологии и биохимии, такие как определение целевых последовательностей ДНК для белков. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой простой, безопасный и экономящий время вариант альтернативы использованию радиоактивных зондов.

Для начала данной процедуры приготовьте пятипроцентный нативный полиакриламидный гель, содержащий 0,5x трис-боратный буфер с ЭДТА (TBE) и 2,5% глицерина, используя систему для мини-электрофореза белков. Чтобы приготовить 30 мл раствора геля для четырех гелей, смешайте дистиллированную воду, TBE, персульфат аммония, TEMED, акриламид-бис и глицерин. Сразу же залейте раствор геля в систему.

После полимеризации оберните гели прозрачной пищевой пленкой, предварительно смоченной в 0,5x TBE, и храните их при температуре четыре градуса Цельсия. Затем сконструируйте длинный олигонуклеотид длиной примерно 51 мер. Сконструируйте комплементарные короткие олигонуклеотиды длиной примерно 14 меров с модификацией инфракрасным флуоресцентным красителем на 5'-конце.

После подготовки олигонуклеотидов переведите их в 1x буфер Tris-EDTA до конечной концентрации 100 µM. Для отжига в пробирке объемом 1.5 мл смешайте 0.6 µL короткого олигонуклеотида с красителем Five Prime, 1.2 µL длинного олигонуклеотида и 28.2 µL буфера Tris-EDTA с NaCl. Поместите пробирку в кипящую воду на пять минут, затем выключите источник нагрева и оставьте воду с отожженными олигонуклеотидами охлаждаться в темноте в течение ночи.

Для получения двухцепочечных ДНК-зондов смешайте 30 мкл отжёженных олигонуклеотидов с dNTP, буфером Klenow, 5'-меченным красителем Klenow и дважды дистиллированной водой в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл. Инкубируйте смесь в течение 60 минут при 37 °C в амплификаторе. Затем добавьте 3,4 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции и проведите тепловую инактивацию при 75 °C в течение 20 минут в амплификаторе.

После этого разведите заполненные зонды в буфере Tris-EDTA с хлоридом натрия до конечной концентрации 0.1 micromolar. Храните олигонуклеотиды при температуре minus 20 degrees Celsius в темноте до начала использования. Для приготовления немеченых зондов смешайте 20 microliters длинного олигонуклеотида, 20 microliters длинного олигонуклеотида R и 60 microliters буфера Tris-EDTA с хлоридом натрия в пробирке объемом 1.5 milliliter.

Поместите пробирку в кипящую воду на пять минут, затем выключите источник нагрева и дайте воде с отжиглыми олигонуклеотидами остыть в течение ночи. Приготовьте один миллилитр 5-кратного связывающего буфера, смешав Tris HCl, Sodium Chloride, Potassium Chloride, Magnesium Chloride, EDTA, DTT, BSA и дистиллированную воду двойной очистки. Перед постановкой реакций связывания проведите предварительный электрофорез в 5% нативном полиакриламидном геле в 0,5x TBE и 2,5% glycerol при 80 вольтах в течение от 30 минут до одного часа (или до тех пор, пока сила тока перестанет меняться со временем), чтобы удалить все следы персульфата аммония.

Затем смешайте 4 µL 5x связывающего буфера, от 80 до 200 ng очищенного белка A, 1 µL 0,1 µM зонда, конъюгированного с красителем, и двукратно дистиллированную воду. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. После инкубации внесите весь объем реакционной смеси для связывания в гель и проведите электрофорез при напряжении 10 В/см до достижения желаемого расстояния.

Накройте аппарат для электрофореза алюминиевой фольгой, чтобы максимально ограничить воздействие света на гель. Очистите поверхность сканера инфракрасной системы визуализации дистиллированной водой. Протрите насухо стеклянные пластины с гелем и поместите их на поверхность сканера.

Откройте программное обеспечение для инфракрасной визуализации и перейдите на вкладку Acquire. Для более толстых пластин используйте следующие настройки: 700 для канала, auto для интенсивности, 84 micrometers для разрешения, medium для качества и 3.5 millimeters для смещения фокуса. Выделите область сканера, которую занимает гель.

Наконец, нажмите Start, чтобы начать сканирование. Процесс электрофореза можно визуализировать с помощью красителя для нанесения Orange G, в то время как бромфеноловый синий обнаруживается при сканировании и, следовательно, мешает анализу изображений. Добавление dI-dC в реакцию связывания устранило связывание очищенного белка 6xHis-SOX-2 с ДНК-зондами, меченными красителем по 5'-концу.

Мутант LIM-4 и «холодный» зонд SOX-2 с мутацией в сайте связывания LIM-4 столь же эффективны в конкуренции с зондом, меченным инфракрасным флуоресцентным красителем, за связывание с 6xHis-SOX-2, как и «холодный» зонд дикого типа. Однако эффективность конкуренции «холодного» мутантного зонда LIM-4 и SOX-2 с мутацией в сайте связывания SOX-2 при связывании с 6xHis-SOX-2 значительно ниже, чем у «холодного» зонда дикого типа. Анализ суперсдвига ДНК-комплекса SOX-2 с использованием эпитопов 6xHis и flag привел к появлению полосы суперсдвига ДНК SOX-2.

После освоения эта методика может быть выполнена за два-четыре часа при правильном подходе. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости содержать инфракрасные зонды в темноте. После проведения этой процедуры можно применять другие методы, такие как редактирование генома с помощью CRISPR cas9, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о значимости конкретной последовательности связывания ДНК.

После своего появления этот метод открыл исследователям в области биохимии путь к изучению белок-нуклеиновых взаимодействий на различных модельных организмах. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как определять взаимодействия белков с ДНК с использованием нерадиоактивных меток ДНК. Не забывайте, что работа с акриламидом может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, включая использование средств индивидуальной защиты.