Оптимизированный протокол для электрофоретической подвижности Сдвиг Пробирной с помощью ИК-флуоресцентным красителем-меченных

Общая цель этого анализа заключается в обнаружении взаимодействий белка и ДНК с помощью нерадиоактивных зондов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биологии и биохимии, такие как определение последовательности ДНК-мишени белков. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является легкой, безопасной и экономящей время альтернативой использованию радиоактивных зондов.

Чтобы начать эту процедуру, приготовьте пятипроцентный нативный полиакриламидный гель, содержащий 0,5x трибората ЭДТА или КЭБ и 2,5% глицерина, используя мини-протеиновую гелевую систему. Чтобы приготовить 30 миллилитров гелевого раствора на четыре геля, смешайте дистиллированную воду, КЭ, персульфат аммония, ТЕМЭД, акриламид бис и глицерин. Пропустите раствор геля сразу.

После полимеризации заверните гели в прозрачную полиэтиленовую пленку, предварительно смоченную 0,5x TBE, и храните их при температуре четыре градуса Цельсия. Затем сконструируйте длинный олигонуклеотид примерно на 51 мерс. Разработка комплементарных коротких олигонуклеотидов примерно для 14 меров с модификацией инфракрасного флуоресцентного красителя на пяти основных концах.

После того, как олигонуклеотиды были получены, ресуспендируйте их в буфере 1x Tris-EDTA до конечной концентрации 100 микромоляров. Для отжига смешайте в пробирке объемом 1,5 миллилитра 0,6 микролитра короткого олигонуклеотида с пятью простыми красителями, 1,2 микролитра длинного олигонуклеотида и 28,2 микролитра буфера трис-ЭДТА хлорида натрия. Поместите трубку в кипящую воду на пять минут, затем выключите источник тепла и дайте воде с отожженными олигонуклеотидами остыть в течение ночи в темноте.

Чтобы сделать двухцепочечные ДНК-зонды, смешайте 30 микролитров отожженных олигонуклеотидов с DNTP, буфером Klenow, пятью простыми красителями Klenow и двойной дистиллированной водой в 0,2-миллилитровой ПЦР-пробирке. Инкубируйте смесь в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия в ПЦР-аппарате. Затем добавьте 3,4 микролитра 0,5 молярного ЭДТА, чтобы остановить реакцию, и нагрейте инактивацию при температуре 75 градусов Цельсия в течение 20 минут в ПЦР-машине.

После этого заполненные зонды разбавляют буфером Tris-EDTA хлорида натрия до конечной концентрации 0,1 мкмоль. Храните олигонуклеотиды при температуре минус 20 градусов Цельсия в темноте до готовности к использованию. Чтобы приготовить немеченые зонды, смешайте в пробирке объемом 1,5 миллилитра 20 микролитров длинного олигонуклеотида, 20 микролитров олигонуклеотида Long R и 60 микролитров буфера Tris-EDTA хлорида натрия.

Поместите трубку в кипящую воду на пять минут, затем выключите источник тепла и дайте воде с отожженными олигопластами остыть в течение ночи. Приготовьте один миллилитр 5-кратного связующего буфера, смешав Tris HCl, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, ЭДТА, ДТТ, БСА и воду двойной дистилляции. Перед настройкой реакций связывания предварительно запустите 5%-ный нативный полиакриламидный гель в 0,5x TBE и 2,5%-ный глицерин, чтобы удалить все следы персульфата аммония при напряжении 80 вольт в течение от 30 минут до одного часа или до тех пор, пока ток не перестанет меняться со временем.

Затем смешайте четыре микролитра 5-кратного связывающего буфера, от 80 до 200 нанограммов очищенного белка А, один микролитр 0,1 микромолярного конъюгированного зонда с красителем и воду двойной дистилляции. Выдерживайте смесь при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. После инкубации загрузите всю реакцию связывания на гель и запустите гель с напряжением 10 вольт на сантиметр до желаемого расстояния.

Накройте гелевый аппарат алюминием, чтобы гель как можно дольше оставался в темноте. Очистите станину сканера инфракрасной системы визуализации дистиллированной водой. Вытрите насухо стеклянные пластины, содержащие гель, и поместите их на стол сканера.

Откройте программное обеспечение для инфракрасной визуализации и перейдите на вкладку «Получить». Для более толстых пластин используйте настройки 700 для канала, авто для интенсивности, 84 микрометра для разрешения, среднего для качества и 3,5 миллиметра для смещения фокуса. Выберите область, которую занимает гель на сканере.

Наконец, нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать сканирование. Ход электрофореза можно визуализировать с помощью оранжевого G-нагрузочного красителя, в то время как бромфенольный синий обнаруживается во время сканирования и, следовательно, мешает анализу изображения. Добавление dI-dC к реакции связывания отменило связывание очищенного 6xHis-SOX-2 с пятью первичными ДНК-зондами красителей.

Мутантный LIM-4 и холодный зонд SOX-2, мутировавшие в сайте связывания LIM-4, столь же эффективны, как и холодный зонд дикого типа, конкурируя с инфракрасным флуоресцентным зондом, меченным красителем, за связывание с 6xHis-SOX-2. Тем не менее, конкурентная эффективность мутантного холодного зонда LIM-4 и SOX-2, мутировавшего в сайте связывания SOX-2, намного ниже, чем у холодного зонда дикого типа для связывания с 6xHis-SOX-2. Сверхсдвиговые анализы комплекса ДНК SOX-2 с использованием эпитопов 6xHis и флага привели к сверхсмещенной полосе ДНК SOX-2.

После освоения этой техники ее можно выполнить за два-четыре часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что инфракрасные зонды должны находиться в темноте. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как редактирование генома CRISPR cas9, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как важность конкретной последовательности связывания ДНК.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биохимии к изучению белково-ДНК-взаимодействий в различных модельных организмах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить белок-ДНК-взаимодействия с помощью нерадиоактивных меток ДНК. Не забывайте, что работа с акриламидом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как средства индивидуальной защиты.