Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии

Целью следующих экспериментов является предложение инструмента для ультраструктурных и иммуноизоляционных исследований суспензионных клеток для визуализации в просвечивающей электронной микроскопии. Эта методика проста в использовании, недорога, дает отличное сохранение клеточной структуры. Это культура суспензии клеток.

Сначала клетки собирают с помощью различных центрифугий для получения гранул в микроцентрифужной пробирке. На втором этапе образец быстро замораживается путем погружной заморозки, которая обездвиживает клетки и ограничивает образование кристаллов льда. Затем выполняется замораживание с целью замены воды растворителем, содержащим тетраоксид осмия в качестве фиксатора для стабилизации клеточных структур.

Результаты показывают, что погружная заморозка и замораживание идеально сохраняют инфраструктуру клеток. Химическая фиксация была основным методом фиксации тканей или клеток для просвечивающей электронной микроскопии, но при этом методе обычно наблюдаются артефакты и экстракция клеточного содержимого. Альтернативой химической фиксации является криофиксация.

Этот метод представляет собой лучший выбор для получения высочайшего качества морфологии в тонких срезах смолы. Погружная заморозка — это метод криофиксации, который мгновенно иммобилизует молекулы в клетке, чтобы избежать повреждений, вызванных обычной химической фиксацией. Перед погружением в замораживание образца необходимо подготовить сетку, разрезанную пленкой Формвар, к использованию в качестве основы для замораживания.

Отполируйте стеклянную горку безворсовой тканью до блеска и протрите начисто. Опустите предметное стекло в раствор Формвара 0,3% в хлороформ на несколько секунд и оставьте сушиться в стакане. Манипуляцию необходимо проводить под вытяжным шкафом с использованием средств индивидуальной защиты из-за наличия хлороформа.

После наполнения кристаллизатора дистиллированной водой пропустите над поверхностью воды стеклянный брусок для удаления пыли. Когда пленка высохнет, надрежьте края острым лезвием бритвы, чтобы пленка могла оторваться. Заморозьте предметное стекло, сильно выдохнув на предметное стекло, чтобы слой водяного пара попал на пленку.

Сразу же всплыть пленку на поверхность воды, коснувшись дна горки под углом около 30 градусов к поверхности воды. Медленно опустите горку в ванну, при необходимости снимая пленку. Пленка Формвар медленно оседает на поверхности воды.

Прикрепите пленку к краю кристаллизатора с помощью пинцета. Аккуратно уложите медные сетки 400 меш лицевой стороной вниз на пленку в областях нужной толщины и без складок. Пленку с сетками набирают, накрывая их бумагой Джозефа, пока они плавают на поверхности воды.

Возьмите в руки край бумаги Иосифа и пленка с сетками должна идти вместе с ним. Не позволяйте пальцам касаться поверхности воды, иначе вы рискуете оставить пленку в воде. Дайте сеткам высохнуть за несколько часов до их использования.

Для ультраструктурных исследований положите ампулу с тетраоксидом осмия в стеклянную колбу. Хорошенько встряхните колбу, чтобы разбить ампулу. Добавьте соответствующий объем ацетона 100%, чтобы получить конечную концентрацию 4%. Перемешайте колбу, содержащую сублимологическую среду, и распределите 1,5 миллилитровых аликвот в криовиалы с помощью пластиковой передаточной пипетки.

Перед использованием закройте все крышки и храните в морозильной камере при температуре минус 84 градуса. Для исследований иммуномаркировки белка приготовьте 0,1% уранилацетата в ацетоне. Когда раствор станет прозрачным, фильтруйте с помощью фильтра 0,2 микрометра и распределите 1,5 миллилитров аликвот в криовалиалы.

Перед использованием хранить в морозильной камере при температуре минус 84 градуса. Чтобы убедиться в наличии соответствующей консистенции гранул из различных типов клеток, сырые дрожжевые клетки в минимум полной жидкой среде получают от 10 до девяти клеток. Escherichia coli в среде DTY для получения от пяти 10 до 10 бактериальных клеток.

Leishmania flagellum в среде AM и Trypanosoma brucei в среде SDM79 для получения от пяти до восьми клеток паразита. Переложите питательную среду, содержащую суспензионные клетки, в пропиленовую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение трех минут при плотности 1500 г. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре соответствующей среды для культивирования клеток.

Центрифугировать в микроцентрифужной пробирке в течение одной минуты при 3 900 г. Полностью удалить надосадочную жидкость. Для метода погружной заморозки необходимо использовать баллон с пропаном с трубкой, подсоединенной к баллону с пропаном.

Пропан, будучи потенциально взрывоопасным, осуществляет сжижение в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжном шкафу. Открытый огонь запрещен. При использовании жидкого азота необходимо всегда носить средства индивидуальной защиты, включая криоперчатки.

Положите в лоток из полистирола небольшое количество жидкого азота. Поместите латунный стаканчик в жидкий азот. Появляются пузыри.

Подождите, пока пузырьки утихнут. Затем латунную чашку замораживают. Поместите трубку, подключенную к баллону с пропаном, в контакт со стенкой латунного колпачка.

Осторожно откройте клапан баллона с пропаном. Образуется много дыма, так как пропан не начинает сжижаться. Когда пропан начинает разжижаться, дым исчезает.

Остановите сжижение, закрыв клапан баллона с пропаном и быстро сняв трубку, подключенную к баллону с пропаном. Наполните полистирольный лоток жидким азотом на расстоянии до пяти миллиметров от верхней части латунной чашки. Заморозьте маленькие латунные стаканчики, куда мы будем заменять образец после заморозки, поместив их в жидкий азот.

Поставьте одну чашку на одну пробу. Будьте осторожны и не смешивайте образцы. Для получения соответствующей консистенции гранулы необходимо лишь соблюдать условия культивирования и указанные ранее параметры центрифугирования.

Заморозьте пинцет перед его использованием. Возьмите медную микроскопическую сетку 400 меш, вырезанную с помощью Formvar. Вонзите в гранулу двухлезвийную рассекающую иглу.

Положите, с помощью инструмента, каплю гранулы на сетку. Очень быстро погрузите сетку в жидкий пропан и размешайте несколько секунд. Быстро переложите замороженную сетку в маленькую латунную чашку.

Для каждого образца сделайте не менее трех сеток. Не забудьте заморозить пинцет перед тем, как браться за сетку. Заморозьте пинцет перед его использованием.

Быстро снимите чашку и перенесите замороженные сетки в криовиал с помощью пинцета. Наденьте колпачок обратно на криовиал. Повторите эту операцию для каждой сетки каждого образца.

Закройте крышки и перемешайте криоциал, чтобы убедиться, что образцы находятся в сублимационной среде. Дайте криовиалам постоять трое суток в морозильной камере при температуре минус 84 градуса. Перевозите криовалиалы в полистирольном лотке, чтобы избежать резкого повышения температуры до минус 30 градусов морозильной камеры.

Дайте один час при температуре минус 30 градусов. Переносите криовиалы при температуре минус 15 градусов в течение двух часов, затем поместите образцы при температуре четыре градуса на два часа и на 30 минут при комнатной температуре. Удалите сублимационную среду с помощью пластиковых переводных пипеток и поместите ее в соответствующую бутылку для отходов с четко обозначенным местом.

Положите около 500 микролитров 100% ацетона. Откройте стеклянный флакон, перемешайте криоциал и быстро поместите замещающую среду в стеклянный флакон. Промойте один криовиал 100% ацетоном.

Смойте три раза по 10 минут 100% ацетоном. Перевозите криовалиалы в полистирольном лотке, чтобы избежать резкого повышения температуры до минус 30 градусов морозильной камеры. Дать два часа при минус 30 градусах.

После помещения образцов в полипропиленовую пробирку замените сублимационную среду свежей сублимационной средой и дайте нагреться в течение двух часов при температуре минус 30 градусов. Промывайте один час 100% ацетоном и три раза по часу 100% этанолом. Метод врезной заморозки/замораживания привел к отличному сохранению внутриклеточных структур суспензионных клеток.

У Saccharomyces cerevisiae структуры не сморщены, а цитоплазма выглядит плотной. Кроме того, мембраны гладкие, что является доказательством хорошей сохранности. Все органеллы, такие как ядро, митохондрии и вакуоли, могут быть идеально идентифицированы.

Отличная сохранность также наблюдается у Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei и Escherichia coli. В ядре отчетливо видны двойная мембрана, образующая ядерную оболочку, ядерная пора, тело веретенообразного полюса и рибосомы, прикрепленные к внешней мембране ядерной оболочки. В митохондриях хорошо видны внутренние мембранные инвагинации, называемые cristae.

Важнейшими органеллами являются вакуоли, потому что крупные кристаллы льда могут легко развиваться. На изображении вакуоли отлично сохраняются без повреждения кристаллами льда. Метод врезной заморозки/замораживания также может быть использован для иммунолокализации белка.

Процедура прекрасно сохраняет антигенность белка, и, как упоминалось ранее, органеллы четко идентифицируются. Уже были протестированы различные антитела, нацеленные на различные белки дрожжей, такие как анти-АТФ-синтаза и анти-порин. Такой эксперимент возможен и для различных экспериментальных систем, как в Leishmania, где был локализован белок флабарина.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготовить образцы методом врезной заморозки/замораживания для их визуализации в просвечивающей электронной микроскопии. Этот метод быстрый, простой в использовании, недорогой и обеспечивает отличную сохранность ячеистой инфраструктуры. Будьте осторожны с жидким азотом, но особенно с тетраоксидом осмия и уранилацетатом.

С ними следует работать в вытяжном шкафу с надлежащими средствами индивидуальной защиты, включая лабораторный халат и перчатки.