Измерение нитритов и нитратов, метаболиты в оксид азота Pathway, в биологических материалах с использованием метода хемилюминесценции

Целью данного протокола является использование хемилюминесценции для количественного определения оксида азота в биологических образцах путем количественного определения уровней нитритов и нитратов с использованием растворов трийодида и восстановленного хлорида ванадия. Этот протокол представляет собой мощный инструмент для отслеживания метаболизма оксида азота и передачи сигналов, как региональному, так и продольному, из различных биологических образцов. Главным преимуществом данной методики является ее простота и высокая чувствительность.

Демонстрировать эту процедуру будет Кейтлин Кассель, наш научный сотрудник IRTA. Она покажет нам, как измерить нитрит с помощью хемилюминесценции в сочетании с раствором трийодида. Для начала приготовьте раствор для сохранения нитритов.

Приготовьте раствор, содержащий один 118 миллимолярный НЭМ и 890 миллимолярный ферроцианид калия в дистиллированной воде. Растворите твердые вещества до тех пор, пока раствор не станет прозрачно-желтым без кристаллов. Затем добавьте этот раствор к NP 40 в соотношении объема 9 к 1

Аккуратно перемешайте раствор, чтобы избежать пенообразования. Никогда не закручивайте эту смесь вихрем. Раствор для консервации нитритов можно использовать около недели при хранении при температуре 4 градуса Цельсия.

Протокол может быть использован на многих свежеполученных биологических образцах. В этом случае свежевзятая кровь центрифугировалась для получения образца плазмы для тестирования. Очень важно как можно быстрее обработать кровь или любые биологические образцы, содержащие большое количество белков гема, таких как гемоглобин или миоглобин, потому что белки гема вступят в реакцию с нитритом, и разрушат нитрит.

Теперь, чтобы сохранить большую часть эндогенных нитритов крови, немедленно смешайте плазму с раствором, сохраняющим нитриты, в соотношении 1 к 4 объему по объему. На любом этапе этой подготовки образец можно заморозить на сухом льду. Чтобы депротеинифицировать образец, смешайте его с равной частью холодного метанола.

Затем центрифугируйте образец при 13000 G в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия для осаждения белков. Возьмите надосадочную жидкость и используйте ее для измерения нитритов. Для чувствительного измерения нитритов наиболее эффективным считается раствор, восстанавливающий трийодид.

При его приготовлении убедитесь, что все кристаллы растворились. Храните раствор в темной бутылке и используйте его в течение одной недели после приготовления. Восстановительный раствор хлорида ванадия обеспечивает наибольшую точность измерения нитратов.

Для определения стандартной кривой для нитритов, а также нитратов используется 1 микромолярный раствор нитритов. Настройте анализатор оксида азота в соответствии с инструкцией производителя. Сначала откройте кислородный баллон, включите прибор и подключите его к кислотной ловушке, которая содержит один моляр гидроксида натрия.

Далее откройте гелиевый бак, затем подключите стеклянную реакционную камеру к гелиевому баку. Теперь загрузите в реакционную камеру раствор трийодида для измерения нитритов. Добавьте антипеногаситель.

Отрегулируйте расход газа, чтобы замедлить барботирование. А затем подключаем кислотную ловушку к реакционной камере. Методом проб и ошибок отрегулируйте поток гелия правильно, чтобы он соответствовал всасыванию прибора.

Теперь запустите программное обеспечение Liquid на основе визуального программирования. Сначала включите связь между прибором и программным обеспечением для сбора данных из меню «Данные», а затем начните анализ в главном меню на передней панели. Дождитесь, когда охладитель фотоумножителя остынет ниже минус 12 градусов по Цельсию, и чтобы фотоумножитель стабилизировался.

Примерно через 30 минут базовая линия стабилизируется с точностью до 1 или 2 милливольт. Критична стабильность стоимости, а не сама стоимость. После того как анализатор стабилизируется, используйте хорошо промытый шприц Гамильтона для введения растворов.

Во-первых, введите не менее трех различных объемов стандартного 1 микромолярного нитрита. Вводите растворы в восстановительный раствор через перегородку. Вводите каждый стандарт или образец дважды.

Если ожидается высокий уровень нитритов и образцы проб, рассмотрите возможность введения большого четвертого объема стандартного раствора нитрита для лучшего определения наклона стандартной кривой. Всегда наблюдайте за выходом и ждите, пока анализатор снова стабилизируется до базового уровня, прежде чем вводить следующий образец. На это уходит не менее минуты.

Для получения точных результатов используйте пиковые объемы образцов ниже 700 милливольт. Между прогонами тщательно промывайте шприц деионизированной водой. Очень важно тщательно промыть шприц.

После того, как все измерения будут выполнены, нажмите кнопку «стоп» в программном обеспечении. Данные будут автоматически сохранены. Нажатие кнопки «Преть» приведет к завершению измерения без сохранения данных.

Закройте запорный кран в верхней части реакционного сосуда и отсоедините трубку, соединяющую кислотоуловитель и реакционный сосуд. После проведения эксперимента переведите анализатор в режим ожидания. Нажмите на кнопку анализа на главной панели и подтвердите, что она переходит в режим ожидания.

Далее отключите подачу кислорода. Отсоедините трубку от резервуара O2 к кислотоуловителю. Затем промойте раствор трийодида с помощью гелия.

Далее закройте и отсоедините гелиевый бак от стеклянного реакционного сосуда. Наконец, очистите сосуд с помощью этанола и воды по мере необходимости. Стандарты тестирования вместе с образцами плазмы показывают, что сразу после их впрыска напряжение фотоумножителя увеличивается и возвращается к исходному уровню, как только все нитриты восстанавливаются, что может занять до минуты.

Для количественной оценки сигнала на основе эталонов была построена стандартная кривая, использующая площадь под пиком скачка напряжения. Используя стандартную кривую, количественная оценка образцов была очень воспроизводимой между их дублирующими инъекциями. Хемилюминесценция считается золотым стандартом для определения концентраций нитритов.

После освоения предел чувствительности для нитритов составляет всего двадцать миллимоляров. Самое важное в работе с хемилюминесценцией — это точность. Благодаря высокой чувствительности метода, каждая ошибка повлияет на конечный результат.

Так что не торопитесь и не спешите. После того, как этот метод был разработан в начале 2000-х годов, он проложил путь исследователям к изучению метаболических путей оксида азота и узнал, что дефицит оксида азота вызывает многие заболевания, особенно сердечно-сосудистые.