Иммуноокрашивание Biocytin заполненных и переработанным секций для нейрохимических маркеров

Целью данного протокола является представление эффективного метода идентификации нейронов, поврежденных во время электрофизиологической записи с использованием биоцитина и иммуноокрашивания для восстановления морфологии перед повторным окрашиванием специфическими антителами для определения нейрохимической идентичности. Таким образом, этот метод описывает важный шаг, необходимый для изучения разнообразия в структуре и функциях нейронов. Это важно для понимания их роли в сетях мозга.

Основным преимуществом использования методов последовательной обработки является то, что она исключает потерю данных из-за невозможности восстановления морфологии. Таким образом, это также помогает определить нейрохимические маркеры, которые должны быть проверены в этих клетках. Хотя этот метод описан для морфологического восстановления клеток в толстых срезах, он также может быть применен к тонким срезам и к ранее окрашенным и смонтированным образцам.

Как правило, нейтральные препараты, впервые знакомые с этим методом, могут испытывать трудности при повторном герметизации сомы при отделении от клетки, и могут не дать достаточного времени для успешного заполнения. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку для эффективного биоцитинового наполнения клеток с целью восстановления полной морфологии требуются специальные методы. Чтобы начать эту процедуру, в конфигурации клещей напряжения применяйте небольшие короткие шаги напряжения с помощью функции проверки мембраны в режиме ванны при приближении к элементу.

Наложите пластырь на клетку с помощью отсасывания. Затем удерживайте ячейку при отрицательном напряжении 70 милливольт. Обратите внимание на разработку гигаомного уплотнения.

Компенсируйте емкостные переходные процессы, а затем применяйте контролируемое отсасывание с помощью шприца или через рот для достижения конфигурации всей клетки. Оценка емкости всей ячейки и последовательного сопротивления, а также остановка импульсов мембранного теста. Последовательное сопротивление менее 10 мегаОм является оптимальным.

Это обеспечит создание условий для записи всей клетки для заполнения биоцитина. После завершения физиологической записи восстановите конфигурацию патч-клембы, медленно перемещая записывающую пипетку небольшими шагами, чередуя ее вверх и наружу в режиме напряжения. Наиболее важным шагом в достижении морфологического восстановления клеток является обеспечение повторного герметизации сомы нейрона при одновременном отделении записывающей пипетки от клетки.

Используя функцию мембранного теста, визуализируйте потерю емкостных переходных процессов и коллапс токовых реакций на прямую линию, что указывает на повторное герметизацию ячейки и создание внешнего внешнего участка на кончике пипетки. В то же время, удержание ячейки на деполяризованном потенциале облегчит процесс повторного герметизации. После отделения пипетки от клетки удерживайте срез в записывающей камере в течение трех-пяти минут, чтобы обеспечить транспортировку красителя к дистальным дендритным и аксональным отросткам.

Затем перенесите срез в 24-луночный планшет, содержащий 4% PFA, для фиксации. Через 24–48 часов после фиксации PFA перенесите все фиксированные срезы в нулевую целую одну молярную PBS для хранения перед иммуноокрашиванием. При этой процедуре промойте ткани три раза по 10 минут каждая в нулевой десятой одной молярной ПБС.

Затем заблокируйте ткани 10-процентной блокирующей сывороткой на один час при комнатной температуре. Затем инкубируют срезы в первичных антителах CB1R при комнатной температуре в течение ночи для определения экспрессии каннабиноидных рецепторов типа 1. Затем промойте участки мозга три раза по 10 минут каждый по 0,1 молярного PBS.

Стрептавидин и вторичное антитело к первому первичному антителу добавляют в луночный планшет и выдерживают в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем инкубируйте срезы в конъюгат стрептавидина с красным красителем при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в темноте, чтобы выявить биоцитин. После этого промойте участки мозга три раза по 10 минут каждый по 0,1 моляра PBS.

Чтобы защитить цветение и облегчить удержание в будущем, устанавливайте секции на одинаково удаленной монтажной среде. Запечатайте края покровных стеблей прозрачным лаком для ногтей. На этом этапе снимите лак с ногтей со предметного стекла ватным тампоном из ацетона.

Осторожно снимите покровную крышку щипцами с тонким кончиком и нанесите несколько капель 0,1 моляра PBS на срезы. Крайне важно не повредить технологическую ткань при демонтаже ткани от водной монтажной среды. Осторожно снимите срезы с предметного стекла с помощью тонкой кисти и промойте их в 0,1 моляре PBS в течение 24-48 часов на шейкере, в защищенном от света месте в четырех градусах Цельсия.

Чтобы обеспечить полное удаление монтажного материала, промойте секции один-два раза на следующий день в 0,1 моляра PBS в течение 10 минут каждый раз. Затем инкубируйте участки со вторым первичным антителом холецистокинином в течение одного дня. Промойте участки мозга три раза по 10 минут каждый по 0,1 моляра PBS.

В последующем окрашивают срезы флуорофором, конъюгированным вторичным антителом козы против мыши. Следить за тем, чтобы спектры возбуждающего излучения вторичного антитела не перекрывались со стрептавидином и предшествующими иммунофлуоресцентными красителями. После этого установите секции в водную монтажную среду.

Запечатайте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. После успешного заполнения биоцитина и первого процесса иммуноокрашивания нейронная структура может быть визуализирована и визуализирована, как показано на конфокальном изображении, полученном при 60-кратном увеличении. Срез также подвергался иммуноокрашиванию на CB1R вместе с биоцитином, а иммуноокрашивание CB1R в соме нейронов, экспрессирующих биоцитин, обозначено стрелкой.

Тот же участок был обработан на иммунореактивность CCK через одну неделю, и на изображении показано успешное восстановление иммуномаркировки CCK в нескольких нейронах, обозначенных звездочкой. Обратите внимание, что меченая биоцитином клетка, обозначенная стрелкой, не экспрессировала CCK. Объединенное изображение панелей A, B и C показывает, что все три метки визуализированы надежно, и наложение между биоцитином и CB1R очевидно.

На изображении видно, что второй процесс иммуноокрашивания не ставит под угрозу сигнал от предыдущего процесса окрашивания. Морфология заполненной биоцитином клетки была получена по конфокальным изображениям, полученным до иммуноокрашивания CCK. Важно отметить, что в дополнение к соме и дендриту, аксоны могут быть визуализированы, а также наблюдается совместное мечение CB1R и меченых биоцитином аксональных процессов.

При попытке этой процедуры важно нацеливаться на здоровые клетки, расположенные ниже поверхности среза, чтобы избежать нейронов с разорванными отростками. И это может поставить под угрозу восстановление морфологии. После освоения морфологическое восстановление заполненных биоцитином клеток может быть надежно получено во время записи патч-клэмпа.

Успешное внедрение метода серийного иммуноокрашивания повысит эффективность восстановления данных и облегчит определение характеристик нейронов при стандартной записи с помощью патч-хомута. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как эффективно использовать биоцитиновые клетки для восстановления морфологии нейронов и определения нейрохимических маркеров.